国家高技术研究发展计划(2007AA021206)
- 作品数：8 被引量：31H指数：3
- 相关作者：张敬之方彧聃邬玲仟刘雄昊梁德生更多>>
- 相关机构：中南大学上海交通大学上海市儿童医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- HIV－1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件
- 2010年
- 目的研究HIV-1载体中的一些元件如Rev和Tat蛋白对其骨架的转录及外源基因表达水平的影响。方法将HIV-1表达GFP载体（FUGW）单独或分别与Rev蛋白表达质粒（pLP2）、Tat蛋白表达质粒（pcDNA3.1-Tat），及表达Rev和Tat蛋白的质粒（△8．9）等摩尔共转染人293T细胞后，经实时定量RT-PCR、FACS、荧光显微镜镜检等方法检测，比较其表达量。结果Rev与RRE结合后，载体骨架及外源基因的转录是单独转染FUGW时的3倍，Tat与TAR结合后，则提高其骨架及外源基因的转录近4倍，而Rev和Tat蛋白的协同作用，其转录本则可提高至6倍。FACS和荧光显微镜镜检也显示GFP蛋白表达量明显提高。F-TPO载体（HIV-1载体乳腺特异表达促血小板生成素）与△8．9在小鼠乳腺上皮细胞HC-11共转染和表达，则TPO蛋白的表达量接近pcDNA3．1-TPO载体的8倍。结论HIV-1载体中存在着提高转录和翻译基因的元件，可提高其骨架的转录和外源基因的表达，且该现象并不依赖于细胞类型和外源基因的种类。
- 孙凤强方彧聃王娟张帆马海燕张敬之
- 关键词：TAT蛋白
- 位点特异性重组系统的机理和应用被引量：10
- 2010年
- 位点特异性重组酶识别特定的位点形成联会复合体,并发生DNA链的切割与交换,实现靶位点之间的整合、切离或倒位.这一过程由位于重组酶催化活性中心的酪氨酸或丝氨酸向DNA磷酸骨架发起攻击,形成共价中间体,不需要高能量辅助因子的参与.由于位点特异性重组系统具有高效精确的优点,在基因工程领域得到了广泛的应用.本文从识别位点的性质、重组酶的组成与结构及催化反应的特点三方面对位点特异性重组的机理进行了全面的阐述,并对当前重组酶的应用研究之现状、热点及存在的问题作了深入剖析,并讨论了未来的发展趋势.
- 张霖赵国屏丁晓明
- 关键词：位点特异性重组整合酶
- 核糖体基因区打靶载体电转染肝细胞的孵育条件的优化
- 2010年
- 目的:提高核糖体基因区打靶载体的转染效率,优化其电转染肝细胞的孵育条件。方法:在其它电转染参数一致的前提下,设计了6组不同的孵育条件,通过分析转染后细胞活率以及48h后目的基因GFP的表达效率,来比较多组不同的孵育条件对电转染效率的影响。结果:6组条件中,转染前21℃,1min,转染后21℃,1min孵育,得到的转染效率最优,比其它的条件得到的转染效率高50%。结论:孵育条件的优化能提高为核糖体基因区靶向表达载体在体外电转染肝细胞的转染效率。
- 曹善仁刘慕君刘雄昊伍汇慧邬玲仟梁德生
- 关键词：电转染
- 慢病毒载体介导的转人ahsp基因的β^(654)地中海贫血小鼠的制备被引量：1
- 2008年
- 目的:经慢病毒载体介导,制备转人α血红蛋白稳定蛋白基因(ahsp)的β654地中海贫血小鼠。方法:用巢式PCR从人血DNA中获得人ahsp基因,构建含有人ahsp基因的慢病毒载体,制备假病毒,通过卵周隙显微注射手段将其导入β654地贫小鼠的受精卵,经移植至假孕母鼠输卵管,最终孕育出转人ahsp基因的β654地贫小鼠;分析小鼠体内外源ahsp基因的表达情况及其遗传稳定性。结果:共获得了8只人ahsp阳性小鼠,转基因阳性率为32%(8/25),其中3只同时具有β654突变基因;人ahsp基因在小鼠体内的表达水平维持在小鼠自身ahsp表达量的1%左右,且可稳定遗传至子代。结论:制备了转人ahsp基因小鼠,并可遗传至子代,为在个体水平上研究α血红蛋白稳定蛋白与β地贫之间的关系提供了工具。
- 王宝斌方彧聃郭歆冰任兆瑞张敬之
- 关键词：慢病毒载体转基因小鼠
- 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞被引量：2
- 2009年
- 目的:比较人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)未分化生长的能力。方法:利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs,通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs与MEFs的体外增殖能力。将HDFs作为饲养层细胞与hESCs共培养,传代12代后,检测hESCs碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果:HDFs可连续传代培养15代以上,10代以下的HDFs增殖迅速,而MEFs自第4代起,增殖能力就明显下降;hESCs在HDFs饲养层上可传代培养12代以上,克隆边界清晰,细胞排列紧密,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性,表达了hESCs特异性转录因子。结论:HDFs比MEFs具有更强的增殖能力;HDFs可作为培养hESCs的饲养层细胞。
- 杨俊林刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴奔高庭潘盛邬玲仟梁德生夏家辉
- 关键词：人胚胎干细胞人皮肤成纤维细胞饲养层细胞
- 应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率被引量：15
- 2009年
- 慢病毒载体已经广泛应用于动物模型中基因治疗的研究和转基因动物的制备,而准确地测定重组慢病毒的滴度和感染效率是其关键步骤.通过荧光实时定量PCR的方法定量分析重组慢病毒的颗粒数以及病毒的活性滴度,并以GFP报告基因的方法作为对照来验证定量PCR方法的准确性.研究结果显示,应用荧光实时定量PCR法与GFP报告基因法测定得到的病毒活性滴度成正相关,而且前者可以更加准确地测定病毒滴度和病毒感染效率.
- 马海燕方彧聃张敬之
- 关键词：荧光实时定量PCR病毒滴度
- 胎膜来源的间充质干细胞促进烧伤愈合的研究被引量：3
- 2010年
- 目的:研究胎膜来源的间充质干细胞在治疗SD大鼠Ⅲ度烧伤中的作用。方法:用胰酶消化法分离足月产胎膜细胞,加入Amino-MAXⅡ培养基进行培养。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD73、CD14、CD45。分别用浓度为3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的明胶溶液包被脱细胞真皮(ADM),以5×106/ml的密度将细胞种植在包被和未包被的ADM表面,2小时后收集未贴附在ADM上的细胞,计算细胞种植效率。实验组:以7mg/ml的明胶包被ADM,以5×106/ml的密度种植第2～3代细胞,培养3～5天后,移植至SD大鼠Ⅲ度烧伤创面;对照组Ⅰ移植单纯的ADM,对照组Ⅱ未进行移植,术后定期观察创面大体情况,计算创面收缩率、表皮再生面积比例,第5周切取新生皮肤组织行HE染色。结果:胎膜分离的细胞以长梭形为主,表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29、CD73,极少表达造血细胞标志物CD14、CD45。不同浓度明胶溶液包被和未包被的ADM,其细胞种植效率均无明显区别(P>0.05);相比对照组,实验组移植物成活时间更长,创面再上皮化时间较早,创面收缩率较小,再生表皮面积亦较多(P<0.05);再生表皮更厚,有明显的表皮突,真皮层毛细血管丰富。结论:成功分离、培养了胎膜来源的间充质干细胞。胎膜来源间充质干细胞复合ADM可促进SD大鼠Ⅲ烧伤创面表皮再生,加速创伤愈合,抑制创面收缩。
- 刘雄昊戴国胜冯劢赵凯吴奔杨俊林胡友金李卓薛金锋邬玲仟梁德生
- 关键词：胎膜间充质干细胞脱细胞异体真皮烧伤治疗皮肤组织工程
- 寡核苷酸介导的基因原位修复
- 2009年
- 基因原位修复是指一种利用细胞的自身修复机制,定点修复靶基因中突变碱基的策略。目前,基因原位修复在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞甚至动植物模型都有许多成功例子的报道。近年来,该技术在阐明其机制及提高其修复效率等方面取得了一些进展,但仍然面临着一些挑战,需要更深入地了解其潜力及局限性,使之成为治疗许多遗传性疾病的一种有效的方法。
- 孙凤强张敬之
