国家自然科学基金(31170093)
- 作品数:11 被引量:25H指数:3
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- 相关领域:轻工技术与工程化学工程生物学更多>>
- 可同化阿拉伯糖的木糖还原酿酒酵母菌株构建被引量:1
- 2020年
- 【目的】以秸秆等木质纤维素类生物质为原料生产液体生物燃料乙醇,目前生产成本高,大规模工业化生产尚有较大难度。构建能同化阿拉伯糖进行木糖还原生产木糖醇的重组酿酒酵母菌株,以实现原料中全糖利用、生产高附加值产品,实现产品多元化。【方法】首先,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术依次向出发菌株中导入阿拉伯糖代谢途径和木糖还原酶基因,使菌株获得代谢阿拉伯糖和将木糖转化为木糖醇的能力;其次,通过适应性驯化的进化工程手段,提高重组菌株对阿拉伯糖的利用效率;最后,通过混合糖发酵验证重组菌株利用阿拉伯糖和还原木糖产木糖醇的能力。【结果】通过导入植物乳杆菌的阿拉伯糖代谢途径,酿酒酵母菌株获得了较好的利用阿拉伯糖生长繁殖的能力;进一步导入假丝酵母的木糖还原酶基因后,重组菌株在葡萄糖作为辅助碳源条件下可高效还原木糖产木糖醇,但阿拉伯糖的利用能力下降。利用以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基进行反复批次驯化,阿拉伯糖的利用能力得以恢复和提升,得到表型较好的重组菌株KAX3-2。该菌株在木糖(50 g/L)和阿拉伯糖(20 g/L)混合糖发酵条件下发酵72 h时,对阿拉伯糖和木糖利用率分别达到42.1%和65.9%,木糖醇的收率为64%。【结论】本研究成功构建了一株能有效利用阿拉伯糖并能将木糖转化为木糖醇的重组酿酒酵母菌株KAX3-2,为后续构建、获得阿拉伯糖代谢能力更强、木糖醇积累效率更高菌株的工作奠定了基础。
- 黄河浪刁于真杨白雪夏子渊汤岳琴
- 关键词:酿酒酵母木糖醇木糖阿拉伯糖
- 紫外诱变驯化提高酿酒酵母木糖发酵的抑制物耐受性被引量:5
- 2017年
- 利用驯化和紫外处理结合驯化的手段对一株木糖发酵工业菌株的抑制物耐受性进行提升。在反复批次培养过程中不断提高含9种抑制物的混合抑制物浓度,使细胞的生长和发酵逐渐适应高浓度抑制物环境,分离突变菌株并进行评价。紫外处理结合驯化比直接驯化能更有效的提升细胞对高浓度抑制物的耐受能力;通过突变菌株分离和筛选,获得3株抑制物耐受能力高于出发菌株的突变菌株,它们在抑制物浓度100%MI(甲酸1 g/L,乙酸3.5 g/L,乙酰丙酸1.5 g/L,糠醛1.5 g/L,5-羟甲基糠醛1.5g/L,丁香醛0.1 g/L,香草醛0.1 g/L,松柏醛0.025 g/L,肉桂酸0.025 g/L)条件下的木糖消耗率比出发菌株高出11.3%-23.2%。紫外诱变处理结合驯化过程可以有效提高酿酒酵母对混合抑制物的耐受性。
- 张译之苟敏汤岳琴
- 关键词:酿酒酵母燃料乙醇
- 基于连续发酵驯化的高耐盐性酿酒酵母的育种被引量:2
- 2014年
- 耐盐酿酒酵母菌株的育种对降低燃料乙醇生产成本具有重要意义.以具有优秀乙醇发酵能力的工业酿酒母菌株KF-7为出发菌株,通过连续发酵、产孢子及孢子培育、交配等获取稳定耐盐菌株.在盐胁迫条件下利用连续乙醇发酵驯化获得了耐盐突变菌株KF-7(4).在此基础上,通过孢子分离、培养、评价和交配,获得两株耐盐二倍体菌株KF-7(4)-3与KF-7-D1.这3株耐盐菌株在50次转接过程中保持着稳定的耐盐性.并且在9%KCl浓度下,3株耐盐菌株的乙醇发酵能力显著优于出发菌株KF-7:在15%YPD培养基中,发酵36 h时的乙醇浓度比出发菌株KF-7提高了21%.有盐和无盐条件下发酵过程中胞内海藻糖含量分析表明,突变菌株KF-7(4)和菌株KF-7(4)-3即使在无盐条件下的海藻糖积累能力明显高于出发菌株KF-7.本研究获得的变异酿酒酵母菌株具有较高的耐盐性和稳定性,耐盐性与胞内海藻糖积累能力提高相关.因此,基于连续发酵的进化工程手段可以有效地用于培育具有某种稳定性状的酿酒酵母菌株.
- 周利汤岳琴孙照勇木田建次
- 关键词:酿酒酵母耐盐性乙醇连续发酵燃料乙醇海藻糖
- 工业酿酒酵母菌株KF-7对发酵抑制物的耐受性被引量:5
- 2015年
- 木质纤维素原料预处理过程中产生的抑制物是燃料乙醇发酵的一大障碍,要求工业酿酒酵母菌株具有优秀的抑制物耐受能力.利用平板培养和批次发酵两种方式系统评价了弱酸抑制物(乙酸、甲酸、乙酰丙酸)、呋喃类抑制物[糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)]、酚类抑制物(香草醛、丁香醛、苯酚)对工业酿酒酵母菌株KF-7生长和发酵的影响.结果显示,菌株KF-7在批次发酵时细胞生长对抑制物的耐受性优于平板培养.低浓度的抑制物虽然对菌株的生长有一定的抑制作用,但对乙醇的产生具有一定的促进作用;高浓度抑制物显著抑制了菌株的生长,降低了葡萄糖的代谢速率,抑制了乙醇的产生.菌株KF-7对甲酸耐受能力强于乙酸,对乙酰丙酸的耐受能力较弱.在平板生长评价中,糠醛对菌株生长的抑制作用强于HMF,但在批次发酵过程中HMF的抑制作用强于糠醛;该菌株代谢糠醛的能力强于代谢HMF的能力.香草醛对菌株的抑制作用最强,丁香醛相对较弱.在秸秆水解液中,菌株KF-7也表现出良好的乙醇发酵性能.菌株KF-7无论在单一抑制物、混合抑制物或实际水解液条件下发酵,均能达到较高的乙醇收率.本研究表明,菌株KF-7适用于纤维素原料燃料乙醇工业化生产过程.
- 苟梓希李云成谢采芸汤岳琴木田建次
- 关键词:燃料乙醇
- 基于等离子体诱变提高木糖利用重组酿酒酵母的抑制物耐受性
- 2021年
- 木质纤维素原料预处理过程中产生的各种抑制物是燃料乙醇生产的一大障碍,因此要求酿酒酵母菌株具有优良的抑制物耐受能力.相比葡萄糖发酵,酿酒酵母利用木糖的发酵过程对抑制物更敏感.针对一株具有良好木糖发酵能力的絮凝性工业重组酿酒酵母菌株s6,进行常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变,通过平板初筛和发酵复筛,获得一株抑制物耐受性得到显著提升的突变菌株335.与出发菌株s6相比,在含单一抑制物(4.8 g/L乙酸,1.9 g/L 5-羟甲基糠醛,0.46 g/L香草醛)的发酵条件下,突变菌株335利用木糖发酵时的乙醇浓度分别提高了55.0%、13.7%和35.0%,在含混合抑制物(2.4 g/L乙酸+1.3 g/L 5-羟甲基糠醛+0.23 g/L香草醛)的发酵条件下的乙醇浓度提高了37.2%.突变菌株335能够利用含高浓度抑制物的秸秆水解液进行发酵,表现出优良的抑制物耐受能力.本研究结果表明ARTP诱变是获得优良抑制物耐受突变菌株的一种有效手段,突变菌株335对单一抑制物以及混合抑制物均具有较好的耐受能力,具有工业应用潜力.
- 陈栋吴娅菁缪晡汤岳琴
- 关键词:木糖发酵
- “组学”技术在燃料乙醇生产用酿酒酵母菌株构建中的应用被引量:4
- 2014年
- 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是工业乙醇生产广泛使用的微生物,构建能同时发酵戊糖以及具有优良抑制物耐受能力的高产菌株,在燃料乙醇生产技术开发中具有十分重要的地位。基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学和流量组学等"组学"技术可从基因型到表现型不同层次揭示生命活动规律,在燃料乙醇生产用酵母菌株的构建中具有广阔的应用前景,特别是目标基因的识别、代谢途径的优化、代谢机理的揭示等。运用"组学"技术可使菌株构建工作更具靶向性和明确性,更加易于获得目标性状,并大大缩短育种周期。综述了"组学"技术在燃料乙醇生产用酿酒酵母菌株构建中的应用及相关研究进展。
- 李云成汤岳琴木田建次
- 关键词:燃料乙醇酿酒酵母组学技术
- 基于连续发酵驯化的耐酸性酿酒酵母的育种被引量:1
- 2014年
- 本研究以纯合二倍体工业酿酒酵母SC-iso-Kan作为出发菌株进行连续发酵,通过逐步降低发酵体系pH值,对酵母的耐酸性进行长期驯化.从pH 2.7发酵体系分离获得耐酸性突变菌株SCiK12,通过孢子形成、分离和培养,获得两株优秀的耐酸性单倍体菌株SCiK12-B3(MATa)和SCiK12-C(MATα),通过交配获得耐酸性二倍体菌株SCiK12-BC4.在35℃,pH 2.5条件下,利用15%YPD发酵48h,和原始出发菌株SC-iso-Kan相比,菌株SCiK12-BC4(MATa/α)和单倍体菌株SCiK12-B3(MATa)及SCiK12-C3(MATα)基于糖消耗的乙醇收率分别提高了12.5%,17.5%和17.2%.本研究结果表明,连续发酵驯化结合单倍体分离和交配是获得耐无机酸突变菌株的有效手段.
- 罗珠汤岳琴孙照勇木田建次
- 关键词:酿酒酵母乙醇连续发酵耐酸性燃料乙醇
- 转醛醇酶基因差异表达影响酵母发酵木糖及耐受乙酸性能被引量:1
- 2014年
- 【目的】木糖发酵是纤维素燃料乙醇生产的一个关键瓶颈,同时木质纤维素水解液中的乙酸严重抑制酿酒酵母的木糖发酵过程,因此通过基因工程手段提高菌株对木糖的利用以及对乙酸的耐受性具有重要意义。本研究以非氧化磷酸戊糖途径(PPP途径)中关键基因转醛醇酶基因(TAL1)为研究对象,探讨了3种不同启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4,控制其表达对菌株利用木糖和耐受乙酸的影响。【方法】通过同源重组用3种启动子替换酿酒酵母基因工程菌NAPX37的TAL1基因的启动子PTAL1,再通过孢子分离和单倍体交配构建了纯合子,利用批次发酵比较了在以木糖为唯一碳源和混合糖(葡萄糖和木糖)为碳源条件下,3种启动子控制TAL1基因表达导致的发酵和乙酸耐受能力的差异。【结果】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4在不同程度上提高了TAL1基因的转录水平,提高了菌株对木糖的利用速率及乙酸耐受能力,提高了菌株在60 mmol/L乙酸条件下的葡萄糖利用速率。在以木糖为唯一碳源且无乙酸存在、以及混合糖为碳源的条件下,PAHP1启动子控制TAL1表达菌株的发酵结果优于PTDH3和PUBI4启动子的菌株,PAHP1启动子控制的TAL1基因的转录水平比较合适。在木糖为唯一碳源且乙酸为30 mmol/L时,PUBI4启动子控制TAL1基因表达的菌株发酵结果则优于PAHP1和PTDH3启动子菌株,此时PUBI4启动子控制的TAL1的转录水平比较合适。【结论】启动子PTDH3、PAHP1和PUBI4不同程度地提高TAL1基因的表达,在不同程度上改善了酵母菌株的木糖发酵速率和耐受乙酸性能,改善程度受发酵条件的影响。
- 肖琴曾维怡汤岳琴木田建次
- 关键词:木糖发酵
- 不同糖发酵条件下酿酒酵母组成型启动子和诱导型启动子评价被引量:3
- 2019年
- 木糖是秸秆等纤维素类生物质原料中含量仅次于葡萄糖的第二丰富的糖,构建可高效发酵木糖的酿酒酵母菌株是提高原料利用率、降低纤维素燃料乙醇生产成本的基础.外源基因的高效表达以及本源基因的调控都需要选择表达强度合适的启动子.基于比较转录组,在全基因组水平上比较解析酿酒酵母所有基因在发酵葡萄糖、发酵木糖、发酵混合糖(葡萄糖和木糖)条件下的表达强度,拟为构建木糖利用菌株提供一系列备选的启动子库.结果表明,碳源种类对酿酒酵母启动子的强度有显著影响,绝大多数启动子强度受碳源影响显著,有67个启动子的强度在不同碳源条件下保持了相对稳定;启动子PTEF1和PTEF2、PADH1、PCCW12和某些核糖体蛋白基因启动子可在构建木糖利用菌株时作为组成型强启动子,另有中、弱强度的组成型启动子可用于基因表达优化;启动子PYNR071C、PPUT1、PDSF1等可作为利用木糖时的诱导型启动子,使基因在有需要的时候才进行表达.本研究在系统解析全基因组启动子强度和碳源种类的关系基础上,为构建利用不同碳源的酿酒酵母菌株提供了具有不同表达特征的候选启动子库.
- 缪晡苟敏陈栋汤岳琴
- 关键词:启动子酿酒酵母转录组
- 混合糖发酵条件下甲酸抑制木糖发酵的机制被引量:3
- 2017年
- 纤维素燃料乙醇生产面临的一个重要问题是纤维素原料预处理过程中产生多种副产物会显著抑制酿酒酵母的生长繁殖和发酵,其主要成分弱酸类中甲酸被认为具有最强的抑制效应.为了解工业酿酒酵母混合糖发酵时木糖利用被甲酸特异性显著抑制的机制,为发酵菌株的抑制物耐受育种提供依据,以乙酸存在条件下的发酵为对照,研究甲酸存在条件下菌株分别发酵混合糖和单独木糖时的发酵性能以及糖代谢相关基因的表达差异、葡萄糖浓度对菌株发酵木糖和木糖代谢基因表达的影响,同时研究甲酸存在条件下葡萄糖代谢产物乙酸和乙醇对菌株发酵木糖的影响以及混合糖和单独木糖发酵过程中甲酸浓度变化和甲酸脱氢酶基因FDH1转录情况.结果显示:葡萄糖只有在甲酸存在条件下才特异性地显著抑制木糖发酵,木糖消耗速率的下降与木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)酶活下降有关;单独木糖发酵时,只有当乙酸、乙醇和甲酸共存时才表现出抑制效应,且随乙醇浓度增加抑制效应越明显,木糖发酵被抑制与XDH酶活下降有关,但乙酸、乙醇和甲酸三者对木糖发酵的协同抑制效应明显弱于60 g/L葡萄糖存在时的抑制;混合糖发酵时FDH1基因转录被抑制导致甲酸分解缓慢,对甲酸存在条件下木糖发酵被抑制有部分贡献.综上,葡萄糖抑制甲酸分解与葡萄糖代谢产物乙酸、乙醇和甲酸的协同抑制对混合糖发酵时甲酸对木糖发酵特异性显著抑制有贡献,但尚存在其他未知抑制机制,还需进一步深入研究.
- 张影苟敏孙照勇夏子渊汤岳琴
- 关键词:酿酒酵母木糖发酵