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国家自然科学基金(30730094): 作品数：15 被引量：69H指数：4; 相关作者：孔维佳胡钰娟杨阳李隽刘波更多>>; 相关机构：华中科技大学武汉市妇女儿童医疗保健中心湖北省新华医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家杰出青年科学基金“十一五”国家科技支撑计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

不同病毒载体感染内耳组织的比较研究: 2009年; 目的通过血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒感染大鼠内耳组织的比较研究，筛选出更适合内耳基因治疗的病毒载体。方法一定体积的血清5型重组腺病毒液和血清2型重组腺相关病毒液经圆窗膜注入鼓阶外淋巴液，通过荧光共聚焦显微镜、免疫组化、Western免疫印迹及听性脑干反应等方法对两种载体所携带报告基因的表达部位、表达时程以及两种病毒本身对内耳组织细胞生活状态的影响加以比较。结果血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒所携带的增强型绿色荧光蛋白报告基因均可在前庭膜、血管纹、基底膜、盖膜、螺旋神经节区及转染对侧耳表达。rAAV2携带的EGFP蛋白第14天表达开始明显增多，第60天仍可检测到高表达。rAd5携带的EGFP蛋自在耳蜗组织内的表达高峰维持在第1～21天，在30天时表达明显减弱。结论腺病毒的优势在于其基因表达的迅速和高效，而腺相关病毒载体以其长的表达时程，低组织细胞毒性在内耳基因转染中表现出独特的优势。; 杨阳孔维佳胡钰娟钟毅赵学艳彭炜; 关键词：腺病毒腺相关病毒增强型绿色荧光蛋白内耳

重组2型腺相关病毒介导锰超氧化物歧化酶高表达对耳蜗血管纹缘细胞氧化损伤的保护作用被引量：3: 2011年; 目的:探讨以重组2型腺相关病毒(AAV2)介导锰超氧化物歧化酶(MnSOD)高表达对耳蜗血管纹缘细胞氧化损伤的作用及机制。方法:体外培养耳蜗血管纹缘细胞(MCs),分为实验组、对照组及正常组。实验组按感染复数(MOI)为104v.g/cell感染rAAV2-MnSOD-EGFP,同时感染rAAV2-EGFP作对照组及不作处理缘细胞为正常组。荧光显微镜下观察MCs绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况及免疫印迹法(western blot)分析转染后MnSOD的表达水平。实验组及对照组同时暴露于400μmol/L H2O22 h,24 h后比色法测定各组丙二醛(MDA)含量;流式细胞PI荧光标记检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡因子Caspase-3活化片段Cleavedcaspase-3的表达。结果:①各组MCs感染病毒后,生长正常,实验组感染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出现EG-FP的表达,10 d至高峰;且持续细胞体外生长的整个周期。实验组MnSOD的表达及活性明显高与对照组及正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。②经H2O2作用后实验组MDA、Caspase-3活化片段Cleaved caspase-3的表达及凋亡率明显低与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地转染体外培养的MCs使其高表达MnSOD,并对MCs氧化损伤有保护作用,这种保护作用与抑制凋亡因子Caspase-3的活化有关。; 李隽孔维佳赵学艳杨阳胡钰娟; 关键词：血管纹缘细胞锰超氧化物歧化酶氧化应激

病毒与非病毒载体转染新生大鼠血管纹边缘细胞的比较研究: 2008年; 目的通过病毒与非病毒载体对原代培养的新生大鼠内耳血管纹边缘细胞转染情况的比较,选择出适合边缘细胞的基因治疗载体。方法用质粒(pEGFP-N1)、血清5型重组腺病毒(rAd5)以及血清2型重组腺相关病毒(rAAV2)三种载体转染新生大鼠(≤72小时)耳边缘细胞,通过对转染效率、细胞凋亡以及细胞活性的检测将三种载体加以比较。结果对边缘细胞的转导效率依次为rAd5>rAAV2>pEGFP-N1,AnnexinⅤ-APC/7-AAD双染法检测转染阳性细胞的损伤情况依次为rAAV2rAd5>pEGFP-N1。结论病毒载体相对于非病毒载体以其高转导效率、低细胞毒性在对原代培养的新生大鼠耳边缘细胞的转染中表现出明显优势。与血清2型重组腺相关病毒比较,相对高效、低毒性的血清5型重组腺病毒更适用于原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞的基因转染研究。; 杨阳孔维佳李隽胡钰娟钟毅郝亚楠赵学艳彭炜; 关键词：转染边缘细胞

重组2型腺相关病毒介导锰超氧化物歧化酶转染大鼠耳蜗血管纹缘细胞的研究: 2008年; 目的探讨以重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus of the serotypes2,rAAV2)为载体对体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞(Marginal cells,MCs)转染锰超氧化物歧化酶(Manganese SuperoxideDismutase,MnSOD),获得高表达MnSOD转基因缘细胞的可行性。方法实验组按感染复数(MOI)为104v.g./cell对体外培养的血管纹缘细胞转染rAAV2-MnSOD-EGFP,同时设转染rAAV2-EGFP缘细胞作为空载对照组,未转染细胞为空白对照组。荧光显微镜下每2d观察1次MCs的绿色荧光蛋白(Enhenced green fluorescentprotein,EGFP)表达情况。比色法测定各组MCs的MnSOD活性。激光共聚焦显微镜下观察转染rAAV2-MnSOD-EGFP后MnSOD的表达,免疫印迹法(Western blot)定量分析MnSOD的表达。结果(1)各组MCs转染后,生长正常,空载对照组MCs转染rAAV2-EGFP后2天开始出现微弱EGFP的表达,1周后至高峰;实验组转染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出现EGFP的表达,10d至高峰,且持续表达于细胞培养的整个期间。EGFP的表达在荧光显微镜490nm波长激发光下呈黄绿色,弥漫于整个胞质。(2)对激光共聚焦显微镜及Westernblot的检测结果进行分析,实验组较空载对照组和空白对照组的MCs中MnSOD的表达明显升高,差异有统计学意义。结论rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地转染体外培养的MCs并持续高表达MnSOD。; 李隽杨阳孔维佳胡钰娟; 关键词：血管纹缘细胞锰超氧化物歧化酶转染

眩晕疾病的个体化综合治疗被引量：41: 2008年; 目的:综合应用药物、手术和前庭康复训练治疗眩晕疾病,探讨建立眩晕疾病的个体化综合治疗方案。方法:对158例前庭外周性眩晕患者进行两个阶段个体化综合治疗。根据疾病种类,第一阶段制定个体化治疗方案,选择药物、手术或前庭康复训练作为治疗方法;经治疗后疗效不满意的患者在第二阶段进行前庭功能代偿状态和姿势平衡中的感觉整合缺陷模式评价,据此制订治疗方案,综合应用药物、手术和前庭康复训练作为治疗方法,并根据治疗反应进一步修订综合治疗方案。疗效评价方法包括:前庭症状指数(VSI)、平衡功能(计时平衡试验及海绵垫姿势描记)、眩晕障碍量表(DHI)。结果:①VSI结果表明,除头痛症状在治疗前后差异无统计学意义(P>0.05)外,其他5种症状在治疗前后差异均有统计学意义(均P<0.01);②计时平衡试验及海绵垫姿势描记结果均表明治疗前后姿势稳定性提高(均P<0.01);③DHI结果表明,治疗后总DHI平均得分提高了15.97分,治疗前后总DHI得分比较差异有统计学意义(P<0.01),且DHI 3个方面的治疗前后得分比较有统计学意义(均P<0.01);④本组所有患者整体有效率为91.14%。结论:在眩晕疾病治疗中,应针对眩晕疾病病因、前庭中枢代偿状态、感觉整合缺陷类型,制定患者的个体化综合治疗方案,综合应用药物、手术及康复训练等手段治疗眩晕患者。; 孔维佳刘波冷样名; 关键词：眩晕前庭疾病综合疗法

大鼠耳蜗血管纹缘细胞氧化性损伤体外模型的建立: 2008年; 目的建立大鼠耳蜗血管纹缘细胞氧化性损伤的体外模型。方法在体外培养的大鼠耳蜗血管纹缘细胞中加入过氧化氢（H2O2），观察细胞形态结构变化；采用CCK-8（cell counting kit-8）法检测200、300、400、600、800μmol／LH202作用0．5、1、2．4、16、24h对血管纹缘细胞活性的影响；检测不同浓度H2O2作用2h后血管纹缘细胞脂质过氧化产物丙二醛含量的变化；利用碘化丙锭染色流式细胞仪测定细胞的凋亡率；通过免疫印迹法（Western blot）检测凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）活化片段cleaved—caspase-3的表达。结果H2O2作用后血管纹缘细胞出现核固缩、边缘化，胞质浓缩，被膜包裹、隆起，产生凋亡；随着H2O2：浓度的增加、作用时间的延长，缘细胞活性降低；200μmoVL的H2O2作用2h，即可诱导缘细胞凋亡率升高，差异具有统计学意义（P〈0．05）；cleaved．caspase-3在正常缘细胞呈微弱表达，H2O2作用后cleaved—caspase-3表达增强，并随H2O2浓度的增高而增强，但当H20：达到600μmol／L时，表达开始减弱，800μmol／L时仅见微弱表达。结论利用H2O2可成功建立耳蜗血管纹缘细胞氧化性损伤的体外模型，caspase-3的激活参与了缘细胞的氧化损伤过程。; 李隽孔维佳赵雪艳胡钰娟; 关键词：血管纹细胞过氧化氢氧化性应激

耳蜗疾病基因治疗载体: 2008年; 在人类基因组计划的推动下，基因治疗已成为最有希望的治疗策略，在耳聋康复方面，基因工程技术也是一种很有前景的实验和临床治疗手段。基因治疗研究的快速发展对基因导入系统提出了越来越高的要求。本文对近年来常用的耳蜗基因治疗载体进行综述。; 杨阳孔维佳

内耳拟老化大鼠模型对噪声损伤易感性研究被引量：3: 2010年; 目的:应用本研究小组建立的内耳拟老化模型,研究其对噪声损伤的敏感性,并探讨线粒体DNA缺失(mtDNA)在大鼠对噪声损伤易感的可能作用。方法:2月龄Wistar大鼠32只随机分为4组,A组每日皮下注射D-半乳糖150mg/kg体重,持续8周;继而暴露于声强为110dBSPL的噪声环境中,每日连续刺激4h,持续2d。B组每日皮下注射0.9%生理盐水150mg/kg体重,持续8周,然后给予噪声暴露,噪声条件同A组。C组用药方法同A组,D组用药方法同B组,C组和D组均不予噪声暴露。造模后2周测试ABR反应阈改变,并测试各组大鼠膜迷路总超氧化物歧化酶活力(T-SOD)、丙二醛(MDA)水平,同时应用巢式PCR(nestPCR)方法检测大鼠膜迷路mtDNA4834缺失突变,并对PCR产物进行测序。结果:A组大鼠ABR反应阈改变[(66.250±6.409)dBSPL]较B组[(35.625±4.955)dBSPL]明显提高,差异有统计学意义(P<0.01)。A组T-SOD显著下降,MDA水平明显提高,与B组差异有统计学意义(P<0.01)。大鼠内耳组织mtDNA4834缺失突变率分别为:A组87.5%(7/8),B组12.5%(1/8),C组75.0%(6/8),D组0(0/8)。结论:内耳拟老化模型大鼠对噪声性聋易感,大鼠内耳组织mtDNA缺失突变可增加模型大鼠对噪声性听力损伤的易感性。; 许黎胡钰娟孔维佳师洪彭炜胡媛; 关键词：D-半乳糖噪声暴露线粒体DNA突变

动态姿势描记仪及在眩晕疾病中的应用被引量：6: 2008年; 刘波孔维佳; 关键词：眩晕

单侧外周前庭病变患者亚急性期的半规管轻瘫程度与静态姿势平衡被引量：10: 2008年; 目的分析单侧外周前庭病变患者(unilateral peripheral vestibular disorder,uPVD)亚急性期的半规管轻瘫(canal paresis,CP)程度与静态姿势描记(static posturography,SPG)的关系,探讨眩晕患者在前庭代偿过程中前庭眼动反射和前庭脊髓反射功能之间的关系。方法患者组有36例处于亚急性期的uPVD患者,均进行冷热试验及SPG,以CP值为冷热试验参数,同时以人体直立时足底压力中心晃动平均速度(sway velocity,SV)为SPG参数。对照组有36例年龄、性别配对的健康人,以其SPG检查结果作为对照。分析(1)处于亚急性期uPVD患者的姿势稳定性;(2)处于亚急性期uPVD患者CP值与SV间的相关性;(3)分别以冷热试验中的CP值15%和30%进行分组,分析以不同CP值为单侧前庭功能障碍标准划分时,uPVD亚急性期患者SPG结果的差异性。结果(1)两组间SV比较,睁眼时差异无显著性意义(t=0.813,P=0.422),闭眼时差异有极显著性意义(t=2.847,P=0.007);(2)患者组的CP值与闭眼时SV值无相关性(r=0.043,P=0.802);(3)以CP值为15%划分时,≥15%者有25例[SV=(39.100±12.647)mm/s],<15%者有11例[SV=(25.053±9.411)mm/s],两者SV间比较差异有显著性意义(t=3.644,P=0.001)。以CP值为30%划分时,≥30%者有10例[SV=(36.541±10.254)mm/s],<30%者有26例[SV=(30.714±12.497)mm/s],两者SV间比较差异无显著性意义(t=1.743,P=0.092)。结论处于亚急性期的uPVD患者姿势平衡性较健康人群低,提示这部分患者的前庭脊髓反射功能未完全代偿;以不同CP值作为划分单侧前庭功能障碍程度时,其所反映的VSR功能存在不同临床意义,表明在前庭代偿过程中,前庭眼动反射和前庭脊髓反射间存在复杂关系。; 刘波孔维佳赖嫦芹冷杨名周延辉; 关键词：肌肉骨骼平衡

国家自然科学基金(30730094)

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