广东省自然科学基金(021907)
- 作品数：12 被引量：27H指数：4
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- 相关机构：中山大学附属第一医院中山大学华中科技大学更多>>
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- RNAi沉默PSMA基因对前列腺癌LNCaP细胞生物学行为的影响被引量：5
- 2008年
- 目的:构建LNCaP细胞PSMA基因的shRNA真核表达载体,探讨其对LNCaP细胞中PSMA基因表达的干扰作用。方法:针对PSMA mRNA序列设计合成3对编码shRNA的寡核苷酸链,退火形成双链,连接入含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的pSilencer2.1-U6-neo真核表达载体,双酶切及测序鉴定。使用脂质体转染的方法将重组质粒导入LNCaP细胞,G418筛选后RT-PCR、Western blotting检测其对PSMA基因干扰作用,并观察对LNCaP细胞生物学行为的影响。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建shRNA真核表达载体p-shRNA1,2,3转染LNCaP后,对细胞PSMA mRNA表达抑制率分别为33.15%、9.26%、41.97%,Western blotting结果显示对PSMA蛋白表达的抑制率分别为26.26%、6.47%、40.69%。选择抑制效率较高的p-shRNA3进行体外生长及侵袭力实验,发现干扰后对LNCaP细胞侵袭力增强,但是对细胞生长影响不大。结论:成功构建了人PSMA基因的RNAi的真核表达载体,并在LNCaP细胞中有效地发挥了对PSMA基因表达的干扰作用,初步发现PSMA在前列腺癌的侵袭中起负向调节作用,为进一步研究PSMA的生物学功能,探索前列腺癌的发病机制奠定一定的实验基础。
- 曹开源张甜徐霖袁广卿田小东黄小荣丘少鹏
- 关键词：前列腺肿瘤RNA干扰
- 前列腺特异膜抗原剪接变异体的基因结构和多态性分析被引量：2
- 2006年
- 目的:了解PSMA剪接变异体的结构及其多样性,探讨前列腺癌的发生机制。方法:应用cDNA末端快速扩增(RACE)的方法扩增剪接变异体5和3末端,并进行序列测定,分析前列腺癌组织PSMA剪接变异体的结构及其多样性。结果:从前列腺癌组织中发现4种新的PSMA剪接变异体,与已往报道的PSMA剪接变异体相比,新发现的变异体在不同位点存在不同程度的插入及缺失。结论:本研究所发现的新PSMA剪接变异体证实和丰富了PSMA剪接变异体的多样性,为寻求前列腺癌特异性的诊断标志物和治疗靶点提供了新的线索和思路。
- 曹开源肖娜徐霖袁广卿戴淑琴黄小荣田小东丘少鹏
- 关键词：前列腺特异抗原剪接
- 抗前列腺特异性膜抗原膜外区多肽单克隆抗体的研制及初步应用被引量：1
- 2008年
- 目的建立前列腺特异性膜抗原(PSMA)膜外区多肽杂交瘤细胞株,并对其分泌的PSMA单克隆抗体进行初步鉴定,为PSMA的功能研究和人源化抗体的制备奠定基础,以求进一步用于前列腺癌的诊断和治疗。方法使用人工合成多肽免疫BABL/c小鼠,采用PEG融合技术建立杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体。通过免疫荧光法、酶联免疫吸附法及斑点金标法确定单克隆抗体的交叉反应性、亲和力及免疫球蛋白的类型和亚类。结果获得两株可稳定分泌PSMA单克隆抗体的杂交瘤细胞,4F4为IgG1类,1F1为IgG3类。两株单抗均能识别LNCap细胞表达的PSMA蛋白,与不表达PSMA的PC-3、SP2/0等细胞无交叉反应。杂交瘤细胞株1F1培养上清效价为1∶40,腹水效价为1∶6400;而杂交瘤细胞株4F4培养上清效价为1∶80,腹水效价为1∶8000。结论成功地制备出两株抗PSMA单克隆抗体,均具有良好的特异性和亲和力,为进一步建立免疫分析方法,进行PSMA相关研究奠定了基础。
- 曹开源杨羚徐霖袁广卿张甜丘少鹏沈关心
- 关键词：多肽单克隆抗体
- 中国人前列腺特异膜抗原基因真核表达载体的构建和序列测定被引量：1
- 2004年
- 目的 :构建中国人前列腺特异膜抗原 (PSMA)基因编码区序列的真核表达载体并进行序列测定。方法 :从前列腺癌组织中提取总RNA ,采用RT -PCR技术扩增前列腺特异膜抗原的基因编码区序列 ,将序列定向克隆至真核表达载体pcDNA3 0 ,并进行序列测定。结果 :本实验所扩增的中国人PSMA基因编码区序列与Israeli等报道的序列同源性为 99 7% ,目的基因与载体正确连接。结论 :成功克隆了PSMA编码区序列 ,并构建了其真核表达载体 ,为PSMA基因修饰的树突状细胞疫苗的前列腺癌生物治疗奠定基础。
- 曹开源戴淑琴徐霖中袁广卿黄小荣丘少鹏郭琳洁
- 关键词：前列腺特异抗原逆转录聚合酶链式反应克隆分子
- 靶向hTERT基因表达载体的构建和其对人乳腺癌细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响被引量：6
- 2009年
- 目的构建靶向端粒酶hTERT基因mRNA的shRNA质粒表达载体,转染人乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系,探讨其对细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。方法设计合成端粒酶hTERT基因特异性shRNA干扰序列,重组pSuper-retro-puro质粒,转染乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系(转染组),设立正常培养乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系(阴性对照组)和pSuper-retro-puro质粒转染的乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系(空白对照组),利用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附测定法(TRAP-ELISA)检测细胞端粒酶活性,MTT实验及琼脂糖细胞集落形成实验检测细胞增殖能力等。结果成功构建pSuper-retro-puro-TERTRNAi#1、#2质粒并转染乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系,转染后细胞端粒酶活性较转染前明显下调,差异有统计学意义(P<0.005);MTT法检测细胞增殖能力显示,MCF-7及MDA-MB231转染组细胞增殖活性较阴性对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);软琼脂集落形成实验表明MCF-7和MDA-MB231转染组细胞克隆形成能力较阴性对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.001)。结论通过RNAi技术特异性干扰hTERT基因mRNA表达可显著下调细胞端粒酶活性,并可导致细胞增殖能力的减弱,以端粒酶为靶点的基因治疗可能是乳腺癌治疗的一种有效方法。
- 刘祥厦姚陈张辉王三明王深明
- 关键词：乳腺癌端粒酶HTERTRNA干扰
- 树突状细胞体外诱导抗前列腺癌免疫的研究
- 2003年
- 【目的】研究树突状细胞(DC)在体外诱导抗前列腺癌的免疫作用。【方法】自前列腺癌患者外周血中分离 CD34+干细胞,加入细胞因子(rhGM-CSF,rhTNF-α及 rhlL-4)培养;以人前列腺癌细胞系 LNCap 细胞的肿瘤相关抗原(TAA)激活 DC;DC 诱导自体 T 淋巴细胞增殖、分化为细胞毒素性 T 细胞(CTL);检测 CTL 对 LNCap 细胞、HepG2细胞、LOVO 细胞及HOS-8603细胞的细胞毒作用。【结果】前列腺癌患者外周血 DC 能够诱导自体 T 淋巴细胞增殖分化为 CTL,该 CTL 对 LNCap细胞有强大的杀伤力(杀伤率为89%±10%,),对 HepG2细胞,LOVO 细胞及 HOS-8603细胞则无明显的细胞毒作用(杀伤率分别为10%±3%,8%±6%,6%±4%)。【结论】前列腺癌患者外周血 DC 体外能够诱导高效而特异抗前列腺癌免疫。提示DC 可能在治疗前列腺癌及预防前列腺癌术后复发和转移中发挥重要作用。
- 曹开源徐霖袁广卿戴淑琴汤永平丘少鹏
- 关键词：树突状细胞前列腺癌
- 前列腺特异膜抗原基因的克隆和真核表达
- 2005年
- 目的克隆前列腺特异膜抗原(PSMA)基因的编码区序列,并进行真核表达。方法用RT-PCR方法扩增前列腺癌组织标本中的PSMA cDNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA3.0。用脂质体转染法,把pcDNA3.0-PSMA转染哺乳动物细胞,鉴定PSMA蛋白的表达。结果序列测定结果表明,两条引物之间的片断长度为2279 bp,与预期长度一致。将克隆的编码区序列与Genebank的PSMA序列进行Blast对比分析,同源性为99.7%;间接免疫荧光法显示表达的蛋白质为膜蛋白,免疫印迹表明表达蛋白质的分子量为100 000。结论利用RT-PCR技术成功扩增了PSMA编码区序列,经序列分析显示扩增片断的序列正确。构建了PSMA真核表达载体,建立了PSMA稳定表达的细胞株。经免疫分析,证实了真核细胞内表达的PSMA为分子量正确的膜蛋白,且具有良好的抗原性。所获得的PSMA真核表达系统为进一步研究PSMA基因修饰的DCs疫苗对前列腺癌的治疗提供了物质基础。
- 戴淑琴孙秀英王军业曹开源何丽容徐霖袁广卿
- 关键词：前列腺肿瘤前列腺特异膜抗原克隆分子真核表达
- PSMA基因疫苗抑瘤效应及免疫机制的实验研究被引量：5
- 2009年
- 目的:观察表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因疫苗在荷瘤小鼠模型中抑瘤效应并探讨其免疫机制,为前列腺癌的预防和免疫治疗提供实验基础。方法:将PSMA基因疫苗肌注入BALB/c小鼠体内,检测其血清中PSMA抗体水平并观察脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,以sp2/0-PSMA细胞攻击免疫后小鼠,观察小鼠的成瘤率、肿瘤大小、平均瘤重及生存率,评价PSMA基因疫苗的抑瘤效应。结果:PSMA基因疫苗可诱导实验组小鼠产生PSMA抗体,脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,在一定时间内随着免疫次数的增加和时间的延长,抗体水平、脾细胞的增殖和杀细胞毒效应均呈上升趋势。与对照组相比较,实验组小鼠成瘤率低,无瘤生存期延长,肿瘤生长缓慢。结论:PSMA基因疫苗能诱导实验组小鼠产生特异性体液及细胞免疫应答,且有明显的抑瘤效应。
- 汪波曹开源徐向东徐霖袁广卿张甜丘少鹏
- 关键词：前列腺特异性膜抗原抗肿瘤效应
- 新型前列腺特异膜抗原剪接变异体的发现及临床意义初步探讨被引量：7
- 2006年
- 目的:探讨前列腺特异膜抗原(PSMA)及其与前列腺癌发生、发展的关系,寻求更为特异的前列腺癌诊断和治疗的靶点。方法:采用RT-PCR和DNA测序技术,克隆PSMA基因新的剪接变异体,并根据其序列信息,设计特异性引物,检测其在不同病变前列腺组织及不同组织来源肿瘤细胞中的表达。结果:发现了一种新的PS-MA剪接变异体,其在前列腺癌、前列腺增生及正常前列腺组织中的表达率分别为92.6%、78.8%及10.0%,且特异表达于前列腺癌LNCaP细胞株,而在前列腺癌PC3细胞株、膀胱癌、肾癌、肝癌细胞株中均不表达。结论:发现了一种新型PSMA剪接变异体(定名为PSMA5),并证实该变异体与前列腺癌及前列腺增生有明显相关性,为研究前列腺癌的发生机制和寻求前列腺癌特异性诊治靶点提供了新的线索。
- 曹开源戴淑琴肖娜徐霖袁广卿丘少鹏黄小荣
- 关键词：前列腺特异膜抗原剪接变异体前列腺肿瘤
- 基因疫苗pcDNA3.0-PSMA肿瘤细胞模型的建立被引量：2
- 2008年
- 目的构建表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)的肿瘤细胞模型,为基因疫苗的抑瘤效应研究及免疫机制的探讨提供实验材料。方法脂质体转染法分别将PSMA-pcDNA3.0质粒和pcDNA3.0质粒转染至SP2/0细胞,G418筛选后获得了稳定生长的阳性克隆细胞株,RT-PCR、间接免疫荧光法、Westernblot检测PSMA蛋白的表达。结果RT-PCR、间接免疫荧光法和Western blot均证明转染了PSMA-pcDNA3.0质粒的SP2/0细胞表达PSMA。结论成功建立了稳定表达PSMA的小鼠肿瘤细胞模型,最终为前列腺癌的预防和免疫治疗研究打下了坚实的基础。
- 汪波曹开源徐向东徐霖袁广卿张甜丘少鹏
- 关键词：前列腺特异性膜抗原基因疫苗基因表达
