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重组人源脑红蛋白的高效表达、纯化及鉴定被引量：1: 2009年; 脑红蛋白(euroglobin,NGB)是新发现的主要表达于脊椎动物神经元及视网膜中的第三类携氧珠蛋白。已有诸多报道认为脑红蛋白在缺氧缺血性脑损伤的神经保护过程中,作为活性氧簇(ROS)的清除剂或缺氧信号的感受器起重要作用,但其神经保护作用的具体机制不明。显然,实现该蛋白的制备对于研究其功能具有重要作用。基于此,通过RT-PCR从人胎脑中扩增出脑红蛋白cDNA并克隆到原核表达载体pBV220,通过测序鉴定正确后转化至大肠杆菌HB101中诱导表达,表达产物超声破碎后经凝胶过滤柱Sephacryl S-200和阴离子交换柱QSepharose F纯化,最后通过SephadexG-25脱盐。经15%SDS-PAGE和Western blot检测及质谱和蛋白序列分析鉴定制备的蛋白样品为脑红蛋白,表达菌体、超声后上清及纯化蛋白溶液均呈现红色,说明具有珠蛋白的典型活性。采用两步法实现了脑红蛋白高效纯化,且确保了其具有明显活性,为进一步揭示脑红蛋白神经保护作用的功能及机制等奠定了重要基础。; 吴永红王利红高艳张成岗; 关键词：脑红蛋白原核表达蛋白纯化蛋白鉴定

人源胞红蛋白转基因秀丽线虫的制备与鉴定被引量：1: 2009年; 目的:为了以秀丽线虫为模式生物研究人源胞红蛋白(human cytoglobin,hCGB)的生理功能,构建hCGB的秀丽线虫表达载体,并通过显微注射的方法制备转基因线虫。方法:将通过RT-PCR获得的hCGB的cDNA序列亚克隆到pFX-unc-119表达载体中,通过显微注射的方法获取染色体外转基因线虫,采用紫外线(UV)照射的方法,筛选获得整合到染色体中的株系,并采取Western印迹和免疫组织化学法鉴定外源基因的表达。结果与结论:成功地构建了hCGB基因的表达载体并获得了3个hCGB的转基因线虫株系,同时获得了3个作为功能对照研究的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因线虫株系,为深入开展胞红蛋白的功能研究奠定了基础。; 赵娜任长虹张继业庞剑会刘虎岐张成岗; 关键词：胞红蛋白线虫纲秀丽线虫转基因株系绿色荧光蛋白质类

秀丽线虫物理低氧损伤模型的建立与应用: 2011年; 目的:利用秀丽线虫研发合适的低氧损伤模型,以更好地揭示低氧生理和低氧病理的分子机制。方法:通过对秀丽线虫进行不同时间的低氧处理,系统观察线虫的死亡率、运动功能、细胞形态及相关蛋白表达水平的变化,分析低氧对线虫的损伤情况。结果:氧浓度为0.2%的物理性低氧可引起秀丽线虫多种细胞形态发生变化,进而导致线虫死亡,且死亡率随低氧时间延长而持续增加,同时低氧诱导因子(HIF-1)的表达显著上调。进一步通过神经元特异性转基因(绿色荧光蛋白)株系观察到低氧可引起神经元特征性损伤。结论:成功建立有效、简便易行的线虫物理低氧损伤模型,可用于低氧病理和低氧应答分子机制研究。; 任长虹张继业石锦平蒋斌赵娜刘虎岐张成岗; 关键词：秀丽线虫

多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用被引量：4: 2011年; 聚合酶链式反应(PCR)作为常规分子克隆技术已在分子生物学的各个领域得到广泛应用。然而,多重PCR技术应用于质粒拷贝数检测的研究尚未见报道。为深入探索多重PCR在质粒拷贝数测定中的应用,首先利用构建的多重PCR引物设计及评估体系分别针对细菌基因组DNA和质粒载体DNA序列设计多重PCR引物;然后以转化有不同质粒载体的大肠杆菌菌液为模板进行多重PCR反应;最后利用凝胶成像仪采集图像后进行积分光密度分析以获得质粒的相对拷贝数。结果显示通过多重PCR得到的质粒相对拷贝数与Real-time PCR和Southern blot的检测结果基本一致,说明多重PCR可用于质粒拷贝数的定性检测。利用多重PCR技术建立了一种便捷的质粒拷贝数检测方法,为在宿主细胞中快速确定克隆载体或表达载体的相对含量提供了参考。; 李媛任长虹吴永红叶巧石锦平屈武斌郑晓飞刘虎岐张成岗; 关键词：质粒拷贝数多重PCR 菌液实时定量PCR SOUTHERN BLOT

秀丽隐杆线虫双突变株系hif-1(ia04);glb-13(tm2825)的制备与鉴定被引量：1: 2011年; 目的以秀丽隐杆线虫为模式生物研究珠蛋白(globin)13(glb-13)的生理作用,以回交2次的glb-13(tm2825)突变株系和hif-1(ia04)构建线虫双突变株系hif-1(ia04);glb-13(tm2825)。方法 glb-13(tm2825)与野生型N2株系交配获得glb-13(tm2825)的雄虫,再与N2的雌雄同体线虫进行交配,回交2次后,通过单只线虫基因组PCR法鉴定出交配后的纯合体。使用hif-1(ia04)和野生型线虫N2进行交配得到hif-1(ia04)的雄虫,然后再与glb-13(tm2825)雌雄同体线虫交配,通过单只线虫基因组PCR法鉴定出交配后的纯合体。结果获得hif-1(ia04);glb-13(tm2825)双突变株系。结论通过线虫交配回交可以使突变株系线虫保持稳定性状,而突变株系之间的交配可以制备出双突变株系,为深入开展glb-13的功能研究奠定了物质基础。; 石锦平任长虹李媛张成岗; 关键词：秀丽隐杆线虫突变珠蛋白两性畸形低氧诱导因子1

扩容性血液稀释对缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用: 2011年; 【目的】探讨扩容性血液稀释对缺血再灌注大鼠脑损伤的影响。【方法】以健康成年雄性SD大鼠为试验动物,制备缺血再灌注脑损伤模型。于脑缺血2 h后,以生理盐水为血液稀释剂,在再灌注时通过尾静脉注射生理盐水对模型大鼠进行扩容性血液稀释,生理盐水注射剂量分别为0.5,1.0,2.0 mL/只,于再灌注6,9,12,24 h时取大鼠脑样本,制备切片,用2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)染色,然后以图像分析方法计算TTC染色面积和脑梗死体积。【结果】生理盐水血液稀释对缺血再灌注大鼠脑损伤具有保护作用,随着生理盐水注射剂量的增加,SD大鼠脑梗死体积呈降低的趋势,注射2.0 mL生理盐水组脑梗死体积显著低于对照组。【结论】扩容性血液稀释能显著降低大鼠缺血再灌注模型脑梗死面积,对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。; 朱瑞萌刘虎岐张成岗; 关键词：血液稀释脑缺血再灌注脑梗死

DNA解链温度(Tm)不同预测方法的比较被引量：3: 2011年; 目的寻找最优的DNA解链温度(Tm)预测方法。方法使用12种Tm值预测方法计算来自文献中348个实测数据的Tm值,将每种方法预测值与实验标准值的差值进行四分位法作图,并计算各方法残差平方和的自然对数,排序后比较12种预测方法的优劣。结果使用最邻近法并结合SantaLucia 1998热力学参数表和Schildkraut1965盐浓度校正公式所预测的Tm值最接近实测数据。结论最邻近法是最准确的Tm值预测方法,而且当PCR引物的GC含量越接近于50%时,其预测准确率越高。; 张艳春屈武斌卢一鸣周扬张成岗; 关键词：引物探针热力学

利用GSP逆转录结合巢式PCR技术鉴定剪接变体的新方法及其在小鼠TrkC基因变体发现中的应用: 2011年; 目的利用基因特异性引物(gene specific primer,GSP)逆转录结合巢式PCR(nPCR)技术,建立鉴定剪接变体的新方法。方法以小鼠TrkC基因为例,参考其已知变体1和变体2的序列分别设计GSP和nPCR引物,以逆转录产物为模板进行nPCR反应,扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶分离并回收具有递减趋势的DNA片段,利用T/A克隆技术亚克隆到载体pMD19-T进行直接测序,并与小鼠RefSeq数据库进行比对。结果利用GSP逆转录结合nPCR技术不仅可鉴定出TrkC基因的已知剪接变体,而且还能够筛选到TrkC基因的新剪接变体并命名为变体3,与变体1相比属于盒式外显子剪接模式,缺失了变体1的520～2188位共1669 bp。结论利用GSP结合nPCR技术建立了一种鉴定剪接变体的方法,为新剪接变体的挖掘与功能研究以及理解异常剪接相关疾病的机制研究提供了重要参考。; 张艳春严瑞芬吴永红张成岗; 关键词：巢式PCR 神经营养因子3 基因组

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国家科技重大专项(2009ZX09103-616)

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