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粉尘螨消化系统超微结构观察: 2013年; 粉尘螨50只经2.5%戊二醛前固定后,使用1%锇酸后固定,经乙醇梯度脱水、包埋、超薄切片、正染色后,透射电镜观察其超微结构。粉尘螨消化系统由前、中和后肠三部分构成,其中中肠进一步分为前中肠和后中肠。前肠和后肠内覆表皮,中肠内覆微绒毛。此外,前中肠可见多种肠壁上皮细胞,细胞顶端微绒毛较短;后中肠微绒毛极长,肠腔可见围食膜包绕的食物团块,团块内含大量细菌。粉尘螨消化系统各肠道的细胞构成不同,尤其中肠肠壁上皮细胞的形态、种类多样,中肠为粉尘螨消化吸收的主要部位。; 王月明刘晓宇蒋聪利黄礼年孙新刘志刚; 关键词：粉尘螨超微结构

粉尘螨生殖系统超微结构的透射电镜观察被引量：2: 2013年; 本研究主要采用透射电镜观察粉尘螨Dermatophagoides farinae(Hughes)生殖系统超微结构。粉尘螨雄性生殖系统是由精巢、输精管、附腺、射精管、交配器官及附属交配器官组成。精巢内可同时有精子发育各阶段的细胞。精子无核膜、核染色质聚集成束、线粒体缺乏典型的嵴、胞质内有平行排列的电子致密薄片等为其特征性结构。雌性生殖系统由交合囊、交合囊管、储精囊、囊导管、卵巢、输卵管、子宫及产卵管构成。卵巢内可见含多个细胞核的中央细胞,其周为卵母细胞等生殖细胞。该研究丰富了对粉尘螨生殖系统结构的认识。; 王月明刘晓宇黄礼年孙新刘志刚; 关键词：粉尘螨生殖系统卵巢超微结构透射电镜

粉尘螨Der f15的基因克隆与其表达载体的构建被引量：4: 2013年; 先挑取纯培养的粉尘螨,提取总的RNA,后采用RT-PCR方法进行反转录出cDNA.由cDNA提取出目的基因进行片段扩增,产物连接入T载体(pMD18-T).经扩增后,用EcoR I和Xho I双酶切,将目的基因分别连接到pET28和pET32的表达载体上,得到重组质粒pET28和pET32,即粉尘螨的基因克隆与表达载体构建成功.; 李钟鸣邬玉兰刘志刚; 关键词：粉尘螨克隆

过敏性哮喘模型小鼠肥大细胞的活化及细胞因子的变化被引量：2: 2014年; 目的观察粉尘螨粗抗原建立的Bal b/c哮喘模型小鼠肥大细胞的活化及细胞因子的变化。方法将20只Bal b/c小鼠按随机数字表法分为2组:阴性对照组(A组,n=10),使用100μL PBS处理;哮喘模型组(B组,n=10),50μg粉尘螨粗抗原+50μL明矾佐剂分别在第0、7和14d腹腔注射致敏1次,第28天再用50μg粉尘螨抗原滴鼻激发,每天1次,连续7次。末次激发24h测定气道高反应;48h处死小鼠进行眼球取血,进行肺泡灌洗并收集右肺的肺泡灌洗液(BALF),无菌取肺HE染色病理观察、甲苯胺蓝染色观察肥大细胞脱颗粒,制取脾细胞及粉尘螨粗抗原刺激培养。采用ELISA法测定BALF和脾细胞培养上清IL-4、IL-10和IFN-γ以及血清IgE、组胺抗体含量。结果与A组相比:B组气道高反应性和肺部病理显著加重(P<0.01);BALF细胞总数和嗜酸粒细胞数显著增多(P<0.01);肥大细胞脱颗粒现象显著加重;血清抗原特异性IgE水平显著升高(P<0.01);BALF和脾细胞培养上清IL-4和IL-10水平显著升高(P<0.05或P<0.01),IFN-γ水平显著降低(P<0.01);BALF和血清组胺水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论过敏性哮喘模型中肥大细胞被活化。; 姚添淇吴莹莹杨小猛匡渤海刘志刚; 关键词：粉尘螨过敏性哮喘肥大细胞小鼠

粉尘螨体壁及血体腔超微结构观察被引量：1: 2014年; 目的本研究主要使用透射电镜观察粉尘螨(Dermatophagoides farinae)体壁及血体腔超微结构。方法取成年粉尘螨20只,先后用2.5%戊二醛及1%锇酸行前后固定,经脱水、包埋、超薄切片、正染色后行透射电镜观察。结果粉尘螨的表皮由上表皮和前表皮构成,其中上表皮进一步分为表皮质层、蜡层和黏质层,前表皮可分为内表皮和外表皮。前表皮结构分层明显,其内可见许多孔道和薄片。粉尘螨血体腔由体壁围绕而成,各组织器官浸浴在血淋巴中,血淋巴内可见大量线粒体、液泡、糖原颗粒以及少量细菌、吞噬细胞等。结论粉尘螨体壁及血体腔超微结构的观察为其形态学研究提供更全面的实验依据。; 王月明吴琳吴莹莹李盟杨利桃黄礼年孙新刘志刚; 关键词：粉尘螨体壁超微结构

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定被引量：1: 2013年; 目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。; 袁小惠高安健邬玉兰刘志刚; 关键词：粉尘螨 F5 蛋白表达纯化免疫印迹

粉尘螨第十六类变应原的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定被引量：2: 2013年; 目的获得大量具有良好IgE结合活性的粉尘螨第十六类变应原(Der f16)的重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知Der f16基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Der f16基因片段,产物连入pMD32-T载体中。扩增后,利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切将目的基因片段连接到pET32a表达载体上,转化到大肠杆菌(E.coli BL21)中经IPTG诱导表达。表达载体经亲和层析纯化,SDS-PAGE检测蛋白纯度,Western bolt检测变应原免疫学活性。结果以粉尘螨总RNA为模板成功克隆出Der f16基因,与数据库中Der f16基因同源性为100%;经IPTG诱导后,大肠杆菌大量表达Der f16蛋白,所获得的重组蛋白分子质量为73ku,上清及沉淀物均有蛋白表达,且上清表达量高于沉淀物。重组Der f16能够与螨过敏患者血清中的IgE反应,而不与健康者血清中的IgE反应。结论成功构建了Der f16的原核表达载体,并高效表达和纯化出具有免疫原性的Der f16重组蛋白。; 李维中王月明吴莹莹邬玉兰刘志刚; 关键词：粉尘螨克隆纯化

粉尘螨第7类变应原(Der f 7)基因的克隆表达及免疫学特性鉴定被引量：6: 2013年; 目的克隆和表达粉尘螨第7类变应原基因,并鉴定重组蛋白的免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank提供的Der f 7编码区(CDS)(登录号为AY 283292)序列设计特异性引物,逆转录PCR(RTPCR)克隆Der f 7基因。将测序正确的目的片段克隆至pET-32a表达载体,得到的重组质粒pET-32a-Der f 7在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,蛋白质印迹(Western Blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果RT-PCR结果显示,Der f 7基因片段大小约为650 bp。测序结果表明,Der f 7基因片段与已发表的粉尘螨Der f 7基因(登录号为FJ436108)同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组质粒pET32a-Der f 7在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白相对分子质量(M r)约为23 000。Western Blotting分析结果表明,Der f 7重组蛋白可被尘螨过敏患者血清识别。结论成功构建了粉尘螨第7类变应原的原核表达载体,并获得具有免疫原性的Der f 7重组蛋白。; 郑蔓茵邬玉兰闫浩吉坤美刘志刚; 关键词：粉尘螨变应原纯化

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广东省自然科学基金(04554)

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