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应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量被引量：7: 2011年; 为实现人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白((GLP-1A2G)2-HSA,简称GGH)的规模化制备,通过pPICZαB与pPIC9K双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达量。首先运用PCR技术扩增出融合蛋白GGH的基因片段,构建了表达质粒pPICZαB-ggh,并电转至经载体pPIC9K-ggh异位整合的GGH分泌型菌株——毕赤酵母GS115/F2;然后采用免疫学方法并结合高浓度抗生素筛选获得高产菌GS115/F3,在30℃,3%甲醇诱导80 h后GGH的表达量达到了491 mg/L,较GS115/F2提高了49.7%,通过荧光定量PCR发现GGH基因拷贝数在含有双质粒体系的GS115/F3中较出发菌株GS115/F2提高了26.7%。Western blotting杂交表明融合蛋白同时具有人血清白蛋白和人胰高血糖素样肽-1的抗原性。; 王慧窦文芳张晓梅许泓瑜许正宏; 关键词：毕赤酵母荧光定量PCR WESTERN BLOTTING

提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达:人干扰素毕赤酵母表达体系研究被引量：1: 2011年; 以毕赤酵母KM71/IH的hIFNβ-HAS表达体系为研究对象,较为系统地研究了不同因素引起的细胞相对活性变化与毕赤酵母外源蛋白表达的相关性。结果表明:(1)细胞相对活性变化与外源蛋白的表达成正相关;(2)处在对数生长中后期的细胞相对活性最高,更适合用于外源蛋白的表达;(3)诱导阶段的环境因素直接影响诱导期细胞相对活性,合适的甲醇浓度、诱导pH及温度是维持细胞高活性,促进外源蛋白高表达的关键。对于hIFNβ-HAS表达体系最佳诱导条件为:以培养21～24h的细胞为诱导种子,初始甲醇浓度为2%(V/V),pH6.0,25℃,细胞活性维持在98%以上,hIFNβ-HSA表达量高达45.6mg/L,较优化前提高了62.3%。; 窦文芳张旦旦许泓瑜金坚许正宏史劲松陆震鸣; 关键词：毕赤酵母

基于胞内cAMP浓度测定融合蛋白GGH活性的改良方法被引量：4: 2013年; 目的:改良一种基于胞内cAMP浓度变化,用于融合蛋白GGH生物学活性测定的方法。方法:根据融合蛋白GGH是GLP-1类似物,能促进胰岛β细胞增殖,产生胞内第二信使cAMP的原理,利用酶联免疫法测定胞内cAMP的含量。结果:Exenatide或融合蛋白GGH刺激大鼠β胰岛素瘤细胞RIN m5f后,选用100nmol/L IBMX作为cAMP保护剂,用DPBS为药物稀释剂,采用液氮—100℃反复冻融2次裂解细胞,最后用酶联免疫法可稳定的测定上清液中cAMP含量。结论:成功改良了融合蛋白GGH体外高通量生物学活性测定方法。运用此方法可快速鉴定融合蛋白GGH及其它GLP-1类似物的生物活性。; 耿燕任怡琳许正宏窦文芳

毕赤酵母STE13基因敲除对GGH表达及其生物活性的影响被引量：3: 2013年; 目的:重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-GGH表达的人胰高血糖素样肽-1-人血清白蛋白融合蛋白[(GLP-1 A2G)2-HSA,GGH]的细胞活性测评结果显示生物活性较低,这可能与其表达过程中蛋白降解有一定关联。通过对毕赤酵母GS115 STE13基因的敲除,获得一株完整表达蛋白GGH的毕赤酵母宿主,并进一步提高其表达产物GGH的生物活性。方法:采用基于PCR技术介导的Cre-Loxp系统重组技术成功敲除宿主菌GS115的STE13基因,得到一株STE13缺陷型菌株GS115/D13,并通过细胞活性测评系统检测GS115/D13表达产物GGH的生物活性。结果:通过对STE13基因缺陷型菌株GS115/D13与出发菌株GS115/W发酵表达对比,显示GS115/D13菌株表达融合蛋白GGH生物活性有明显提升,且表达量提高了25.8%,两菌株生长无明显差异。结论:STE13基因的敲除成功缓解了GGH表达过程中的降解问题,并相对出发菌株GS115/W大幅度提高了蛋白生物活性。; 路庆鹏许正宏史劲松窦文芳; 关键词：毕赤酵母 GLP-1 生物活性

中温α-淀粉酶高产菌株的选育及其粗酶性质被引量：4: 2011年; 以从自然界中筛选的野生芽孢杆菌XLG-1为出发菌株,通过紫外线诱变及紫外线-氯化锂复合诱变筛选出高产中温α-淀粉酶的优异菌株XLG-51,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。初步研究了其所产的α-淀粉酶的酶学性质:通过SDS-starch-PAGE电泳与酶谱分析得该酶分子质量为60 ku左右,最适作用温度为60℃,最适作用pH范围为5.0～6.5,且在最适条件下具有较强的稳定性。以该菌株为生产菌进行5 L罐发酵实验,产酶达5298 U/mL。; 李文秀张旦旦窦文芳许泓瑜许正宏史劲松陆震鸣; 关键词：枯草芽孢杆菌 Α-淀粉酶诱变

重组白蛋白人胰高糖素样肽-1突变体的串联体的融合蛋白在小鼠体内的药代动力学被引量：4: 2011年; 目的研究重组白蛋白融合人胰高糖素样肽突变体的串联体rh(GLP-1A2G)2-HSA(GGH)在小鼠体内的药代动力学特性。方法采用氯胺T法标记目标蛋白rhGGH,γ放射免疫计数器检测三氯醋酸(TCA)沉淀前后血浆、组织、尿和粪的放射性计数,用DSA1.0软件拟合药物动力学模型,并计算相应动力学参数。结果 125I-rhGGH单次单剂量皮下注射后在小鼠体内的动力学过程符合二室模型,分布容积为53.4 mg.L-1.h-1,体内吸收相半衰期T12α为26.6 h,体内消除相半衰期T12β为57.8 h。125 I-rhGGH在小鼠甲状腺、血、胃、肝、肾、肺等组织器官中有较高的放射性摄取,而心、脑、胰腺、脾其它组织中放射性活度较小。125I-GGH主要经肾由尿排泄,给药后306 h,79.3%的药物由尿排出。结论小鼠体内的药代动力学表明rhGGH体内的半衰期明显优于非融合人胰高糖素样肽-1,因而使用rhGGH可以减少给药次数,并有可能提高疗效。; 窦文芳许正宏张晓梅许泓瑜雷楗勇金坚; 关键词：药代动力学血药浓度排泄小鼠

基于蛋白酶活性控制的重组人β干扰素毕赤酵母表达体系优化: 2012年; 以毕赤酵母人β干扰素表达体系为研究对象,考察与蛋白酶活性相关的营养和环境因素对外源蛋白hIFN-HAS表达/降解的影响。结果表明,pH、谷氨酸和EDTA是显著影响hIFN-HAS表达的3个因素。通过响应面分析得到hIFNβ-HAS表达的最优条件为pH 5.5、谷氨酸0.18%、EDTA 12 mmol/L,目的蛋白表达量为24.46 mg/L。发酵终产物的电泳结果表明:条件优化后,hIFNβ-HSA降解带明显变淡,说明营养和环境因素的优化一定程度上抑制了蛋白酶的活性,由此增加了目的蛋白的积累。; 张旦旦窦文芳许正宏史劲松; 关键词：毕赤酵母 Β干扰素融合蛋白蛋白酶酶活性

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国家自然科学基金(31000016)