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绵羊肺腺瘤内、外源性env基因比较分析被引量：2: 2013年; 绵羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA)是由绵羊肺腺瘤反转录病毒(Jaagsiekte retrovirus,JSRV)感染引起的成年绵羊的一种慢性、进行性、接触传染性肺脏疾病。env是JSRV的主要毒力基因之一,而在正常羊的基因组中也存在着JSRV的内源性基因片段。为比较分析JSRV内、外源性env的特征,本文扩增并测定了正常绵羊肺组织的内源性env基因(Enenv),运用生物信息学技术,比较分析了其与外源性绵羊肺腺瘤病毒JSRV21(AF105220)env基因(Exenv)的遗传进化关系,二、三级蛋白结构和抗原表位。结果表明Enenv和Exenv核苷酸同源性为88.1%,推导的氨基酸同源性为92.0%,两者的主要差异位于TM区和YXXM基序。本结果为进一步研究JSRVenv基因功能提供了新线索。; 孔汉金张克山刘永杰尚佑军吴斌刘湘涛; 关键词：ENV基因

亚细胞蛋白质组研究进展被引量：3: 2013年; 随着蛋白质组学研究的不断细化和深入,亚细胞水平的蛋白质组成为当前蛋白组学研究的热点之一。亚细胞蛋白质组学研究可以减少全细胞蛋白组分析的复杂性,其研究内容主要包括亚细胞水平的蛋白质组组成、功能、定位及其相互作用。比较、鉴定、分析正常生理状态和病理状态下亚细胞蛋白质组的差异表达蛋白并研究其功能,成为寻找疾病特异生物标记,揭示致病机理的有效途径之一。论文就蛋白质组学在不同亚细胞水平的应用和研究现状、面临的挑战以及未来的发展方向做一综述。; 孔汉金张克山刘永杰尚佑军吴斌刘湘涛; 关键词：蛋白质组学亚细胞

羊口疮病毒ORF125基因编码蛋白的结构预测及其在真核表达质粒转染细胞中的定位: 2014年; 旨在预测羊口疮病毒(ORFV)ORF125蛋白结构及其在真核表达质粒转染细胞中的定位。设计引物PCR扩增ORF125基因,并将其定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定后得到阳性重组表达质粒pEGFP—ORF125。利用DNAStar和MEGA4.0元件分析不同毒株间ORF125基因的遗传进化关系,接着通过在线Expasy工具预测其二级结构并与Bcl-2家族成员进行比较。利用脂质体介导法转染山羊皮肤成纤维细胞(GSFs),经DAPI染色后在激光共聚焦显微镜下观察ORF125的亚细胞定位。结果显示:本次克隆的ORFV ORF125基因与国外公布的其他羊口疮毒株核苷酸水平相似性为97.1%~98.1%,与同属另外2株羊伪牛痘病毒相比,核苷酸相似性分别为84.1%(GQ329669)和85.6%(GQ329670);蛋白二级结构预测分析发现ORF125与Bcl-2家族成员α-螺旋位置相近,预测空间结构有很大的相似性;激光共聚焦显微镜观察发现ORF125在GSFs细胞质中呈弥散性分布。结果提示,羊口疮病毒ORF125基因非常保守,预测与Bcl-2蛋白有着相似的功能,重组质粒pEGFP-ORF125构建成功,ORF125基因在GSFs中得到表达,定位于细胞质中。; 孔汉金张克山刘永杰尚佑军刘湘涛吴斌; 关键词：羊口疮病毒亚细胞定位基因结构

同位素标记相对和绝对定量蛋白组技术研究进展被引量：4: 2014年; 近年来定量蛋白组学技术迅速发展,目前常用的有双向荧光差异凝胶电泳、同位素亲和标记、15N同位素标记、同位素标记相对和绝对定量和细胞培养条件下稳定同位素标记技术等。同位素标记相对和绝对定量技术以其高通量、高灵敏度、高重复性、高动态检测限和能对各种复杂样品进行相对和绝对定量研究等优势而备受研究者青睐,目前已发展到在同一实验中分析8组样品,增加了实验设计的灵活性。我们就同位素标记相对和绝对定量技术在定量蛋白组史中的地位作用、研究策略,以及在病毒致病机制研究和医药临床相关问题中的应用做简要综述。; 孔汉金张克山刘永杰尚佑军吴斌刘湘涛; 关键词：定量蛋白质组学病毒

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定被引量：7: 2014年; 为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。; 孔汉金张克山刘永杰尚佑军刘湘涛吴斌; 关键词：羊口疮病毒杂交瘤单克隆抗体 ELISA

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家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金(SKLVEB2012KFKT009)