辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(2009A481)
- 作品数：2 被引量：4H指数：1
- 相关作者：霍晓川关宁罗俊生冯旭顾立学更多>>
- 相关机构：辽宁医学院辽宁医学院附属第一医院更多>>
- 发文基金：辽宁省自然科学基金辽宁省教育厅高等学校科学研究项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染被引量：1
- 2011年
- 目的构建人胆固醇酯水解酶(hCEH)绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH,并观察其转染单核巨噬细胞株U937后,细胞中hCEH的表达情况。方法以人肝细胞L-O2总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hCEH编码区序列,将扩增片段插入到pMD19-T载体中,回收、纯化目的片段后亚克隆到pEGFP-N1真核表达载体上,经双酶切、测序鉴定后,转染U937,观察U937中绿色荧光蛋白的表达情况。结果 RT-PCR扩增hCEH基因的编码区序列获得1条约1.7 kb的片段,与预期片段大小相符;以pEGFP-N1为载体,成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-hCEH,该质粒可以在U937中表达。结论成功构建pEGFP-N1-hCEH,用其转染U937后,细胞中pEGFP-N1-hCEH大量表达。
- 顾立学罗俊生王瑞冯旭关宁霍晓川
- 关键词：真核表达载体单核巨噬细胞U937细胞转染
- 人胆固醇酯水解酶重组腺病毒载体的构建被引量：4
- 2011年
- 目的构建人胆固醇酯水解酶(hCEH)基因重组腺病毒载体,并在人胚肾细胞(HEK293)中扩增。方法将hCEH基因整合入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hCEH,线性化后与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组质粒pAd-hCEH,酶切后用脂质体转染HEK293,包装成重组体腺病毒Ad-hCEH,经扩增和纯化得到高滴度重组病毒。采用PCR法进行鉴定,绿色荧光蛋白(GFP)追踪,荧光显微镜下观察并计算Ad-hCEH病毒滴度。结果重组穿梭质粒及其载体经鉴定后,电泳结果与预期相符。Ad-hCEH-EGFP感染HEK293后,随时间增加,HEK293表达绿色荧光的量也增加。hCEH碱基序列经测序与Genebank中已知序列完全吻合。Ad-hCEH电泳结果显示1 700 bp附近有一条带,与目的片段相符合。最终测得Ad-hCEH滴度为1.2×1010 pfu/ml。结论成功构建了携带hCEH基因的重组腺病毒载体。
- 张兴海罗俊生霍晓川顾立学关宁冯旭
- 关键词：腺病毒质粒人胚肾细胞
