国家高技术研究发展计划(2003AA205005)
- 作品数：6 被引量：21H指数：4
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- 相关机构：中山大学广州医学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划广东省科技计划工业攻关项目国家教育部博士点基金更多>>
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- 蛋白激酶C_α在小鼠胚胎干细胞定向分化中对发育基因表达的调控作用被引量：1
- 2005年
- 目的探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对小鼠胚胎干细胞(ESCs)定向诱导分化中发育基因(pax6、slit2、netrin1)表达的影响。方法ESBALB/c细胞株用无白血病抑制因子(mLIF)的ESCs培养液培养4d,形成胚胎体(EBs),再分别种植于预置有盖玻片的6孔板和直径100mm的培养皿,经5×10-7mol/L视黄酸(RA)诱导后,用神经细胞特异性抗原NSE和NF200来鉴定分化细胞的类型,在诱导后1、3、5、7及14d用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法测定细胞的PKCα和发育基因的mRNA表达情况,并观察了PKC激活剂佛波酯(PMA)和PKC抑制剂D鞘氨醇对它们表达的影响。结果免疫组化发现在诱导后第3d大多数细胞NSE和NF200染色阳性,RTPCR证实诱导后1dPKCα、pax6和netrin1的mRNA表达急剧下降,3~7d逐渐升高,至14d恢复至正常水平,而slit2在诱导前后均无明显表达。PMA可使PKCα、pax6、netrin1的mRNA水平在诱导后细胞中的表达明显增强,而D鞘氨醇的作用相反,使它们的表达显著降低,而对slit2无明显影响。结论发育基因pax6和netrin1在ESCs定向分化为神经样细胞中有重要的调控作用,可能是通过PKCα信号通路起作用。(中华眼科杂志,2005,41123127)
- 高前应葛坚王智崇陈慧怡黄丹平袁钊辉
- 关键词：蛋白激酶CΑ胚胎干细胞视神经疾病
- 猴表皮干细胞横向分化为角膜上皮细胞的研究被引量：8
- 2006年
- 表皮干细胞可以作为角膜上皮细胞的替代物，在自体眼表修复及组织工程生物角膜的构建中将产生不可估量的作用．将体外分离培养的2～4代猴表皮干细胞和人角膜缘基质组织及角膜上皮细胞进行共培养Crranswell法），于共培养前后使用流式细胞仪、RT—PCR和免疫组织化学技术对其分化情况进行检测和鉴定．并于第2，4，6，8和10天进行免疫组织化学染色观察表皮干细胞转分化的比率．实验采用条件培养基诱导法作为对照．表皮干细胞在共培养前表达表皮干细胞标志，K15和整合素β1阳性，K3／K12阴性；共培养后转为表达K3／K12，从基因水平和蛋白质水平表现出角膜上皮细胞的特征，但是条件培养基诱导法阳性率较低．可见，表皮干细胞具有可塑性，在角膜缘基质组织及角膜上皮细胞的调控下，可以横向分化为类角膜上皮细胞，有可能重建角膜上皮，进行自体生物角膜的构建．
- 高楠王智崇黄冰葛坚陈系古卢蓉张可飞范志刚卢丽彭展崔光辉
- 关键词：表皮干细胞角膜上皮细胞
- 应用原瓶黏附分选表皮干细胞的方法学特点被引量：3
- 2006年
- 目的:探索一种简单易行的方法分离表皮干细胞,为组织工程学的进一步研究奠定基础。方法:实验于2005-07/12在中山大学眼科中心国家眼科学重点实验室完成。健康3个月龄恒河猴2只,分离与培养猴表皮细胞,获取第2～4代的细胞,消化后,将细胞重新放回原瓶中,培养箱中静置20min,获得的贴壁细胞即为快吸附的表皮细胞。①于光学显微镜下观察分选前细胞和快吸附细胞。②对20min快吸附的表皮细胞进行整合素α6和CD71流式细胞仪检测,以未经吸附分选的细胞作为对照。③20min快吸附的表皮细胞和分选后未黏附细胞分别制作3组细胞爬片,进行整合素β1、K15、和K10的免疫组织化学染色。④20min快吸附的表皮细胞和分选后未黏附细胞进行K15、整合素β1和K1(K10对应角蛋白)的mRNA反转录聚合酶链反应的检测。结果:①分选后的细胞体积较小,核浆比例较大。②流式细胞仪的结果显示快吸附细胞以干细胞为主(α6briCD71dim为82.5±1.641),也含有少量的短暂扩增细胞(α6briCD71bri为4.9±2.125),有丝分裂后细胞及终末细胞则检测不到(α6dim)。③免疫组化可见快吸附细胞呈K15和整合素β1阳性,K10阴性;分选后未黏附细胞K10为阳性,而K15和整合素β1均为阴性。④反转录聚合酶链反应示吸附分选后的快吸附细胞高表达K15和β1整合素,K10没有表达;而分选后剩余的细胞只表达K10。结论:原瓶黏附分选方法是一种简单可行的分选表皮干细胞的方法。
- 高楠黄冰葛坚王智崇陈系古张可飞彭展李彦峰
- 关键词：表皮干细胞细胞分离
- 体外诱导恒河猴皮肤干细胞分化为结膜上皮细胞的实验研究被引量：4
- 2005年
- 目的诱导体外培养、纯化的恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化,探索皮肤干细胞的可塑性。方法体外培养恒河猴皮肤干细胞,用Ⅳ型胶原纯化,纯化前后用流式细胞仪检测β1整合素和角蛋白15阳性细胞比例,纯化后的皮肤干细胞用细胞免疫荧光和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术鉴定β1整合素和角蛋白15。皮肤干细胞转染绿色荧光蛋白基因,24h后挑选出有荧光的细胞,与人结膜上皮细胞共培养10d,再进行结膜上皮细胞的特异性抗原黏蛋白4和角蛋白4的鉴定,检测方法包括细胞免疫荧光和RTPCR。结果体外培养的皮肤干细胞纯化后比例接近90%。细胞免疫荧光和RTPCR检测β1整合素和角蛋白15阳性。转染绿色荧光蛋白基因24h后,细胞呈现绿色荧光,与结膜上皮细胞共培养10d后,细胞免疫荧光和RTPCR检查黏蛋白4和角蛋白4阳性。结论在体外培养纯化的灵长类动物恒河猴皮肤干细胞,在适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。
- 卢蓉葛坚黄冰黄丹平高楠魏雁涛王智崇彭展
- 关键词：干细胞结膜上皮细胞皮肤干细胞恒河猴体外诱导绿色荧光蛋白基因逆转录-聚合酶链反应
- 猴表皮干细胞的分离和培养被引量：5
- 2006年
- 目的:探索猴表皮干细胞分离纯化和培养方法。方法:将猴皮肤标本剪成皮条,加入0.25%胰酶浸泡过夜;然后去除角质层,刮上皮面获取表皮细胞进行培养。取第2-4代的细胞,经消化后,用Ⅳ型胶原黏附法获得为快吸附的表皮细胞。对快吸附的表皮细胞行流式细胞仪、免疫组化和RT-PCR检测。结果:快吸附细胞从mRNA转录水平及蛋白表达水平均呈现表皮干细胞的特性:β1整合素、K15和α6整合素阳性,而CD71和K1/K10阴性。结论:所采用的分离纯化方法和培养条件适合猴表皮干细胞的分离纯化及生长。
- 张可飞黄冰葛坚王智崇陈系古高楠彭展李彦峰
- 关键词：恒河猴表皮干细胞
- 兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究被引量：4
- 2006年
- 目的观察人骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。方法24只新西兰兔随机分为2组。实验组:培养有人MSCs的羊膜移植组,将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d,用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后移植到兔眼表结膜缺损区;对照组,单纯羊膜移植组。分别于移植后1,2,3,4,6和8周,摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查,组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况;免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3/12(CK3/CK12)和角蛋白13(CK13)的表达。结果MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长,与羊膜共培养4d后,MSCs贴附羊膜生长迅速,组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区,术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性,CK3/CK12表达阴性,在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞,未见异常增殖细胞。结论人羊膜可作为MSCs的载体,采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植,MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。
- 黄丹平郑健梁高前应葛坚刘金陵
- 关键词：羊膜结膜上皮细胞
- 囊胚显微注射建立嵌合体动物进行表皮干细胞可塑性的初步研究
- ＜正＞目的:我们前期工作发现给予特定的微环境,表皮干细胞在体外可以分化为结、角膜上皮样细胞。鉴于此,通过构建猴—鼠嵌合体模型,进一步研究表皮干细胞在体内胚胎微环境中是否具有多向分化的潜能,从而为成体干细胞可塑性研究提供良...
- 江儒章葛坚黄冰宋革段永恒刘敬波孙雪荣贾秀华
- 文献传递
