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国家自然科学基金(30400120): 作品数：12 被引量：22H指数：2; 相关作者：周平坤孙薏徐勤枝黄越承隋建丽更多>>; 相关机构：军事医学科学院首都医科大学解放军第452医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国际原子能机构基金北京市教委科技发展计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学农业科学建筑科学更多>>

反义RNA抑制人黑色素瘤细胞表面粘附分子CD44的表达及抑瘤效应被引量：1: 1997年; 将细胞表面粘附分子ＣＤ４４Ｓ的ｃＤＮＡ反向插入到真核细胞表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ－ＣＡＴ和ＭＭＴＶ－ＬＴＲ启动子下游，构成ＣＤ４４Ｓ的反义ＲＮＡ载体．将其用电击法导入ＣＤ４４＋的人黑色素瘤细胞系ＨＭＭ２３９，转录出的反义ＲＮＡ能不同程度地抑制ＨＭＭ２３９表面ＣＤ４４的表达．ＣＤ４４的表达被抑制后，瘤细胞与透明质酸的结合力下降，细胞的体外生长速率不受影响．将其接种裸鼠皮下。; 罗振革高杰英李红彭虹朱锡华; 关键词：CD44 黑色素瘤致瘤性

HIV-1 Tat蛋白对DNA修复基因及细胞周期相关基因表达的影响被引量：1: 2009年; 目的:探讨HIV-1 Tat蛋白对DNA修复基因及细胞周期相关基因表达影响。方法:使用包含102个与DNA损伤修复和细胞周期相关的基因微阵列检测人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)基因表达谱的改变;使用半定量RT-PCR分析DNA-PKcs在mRNA水平表达;Western印迹法检测DNA-PKcs表达变化;荧光染色法检测电离辐射后细胞凋亡。结果:在基因芯片的检测中,发现与DNA损伤修复及细胞周期调控相关的6个基因CdC25C、KIF2C、CdC20、DNA-PKcs、CTS1、WEE1在转染tat基因的细胞中表达下调;DNA-PKcs的表达在表达Tat蛋白细胞中不论是在mRNA和蛋白水平均被抑制;接受电离辐射后,表达Tat蛋白的细胞凋亡增加。结论:HIV-1 Tat蛋白使细胞对电离辐射敏感,部分通过抑制DNA-PKcs表达来降低DNA双链断裂的修复能力,本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性提供了重要实验数据。; 孙薏周平坤匡红张聪呼永河冯怀志李硕徐勤枝陈健; 关键词：HIV-1 TAT 基因表达细胞周期

γ射线照射对IER5基因mRNA表达的影响被引量：9: 2008年; 目的应用实时PCR技术分析^60Coγ射线照射正常人淋巴母细胞（AHH1）、宫颈癌细胞（HeLa）与接种人肿瘤细胞的裸鼠后IER5基因表达的影响。方法对于离体培养的AHH1、HeLa与BALB／c—nu裸鼠，按照不同剂量（0．5、2、4、6、10、15Gy）与照射后不同时间点（2、4、8、12、24h）进行分组进行提取mRNA、反转录与IER5基因表达量测试。结果在相同条件下AHH1对照射比HeLa更灵敏，其表达量的峰值对应的剂量比HeLa的要低。对于AHH1细胞，对2Gy低剂量的照射反应比10Gy的高剂量反应要快，而HeLa细胞，对于2Gy的低剂量与10Gy的高剂量的照射反应没有太大差异，在照射后2h都出现基因表达的最大值。此外，人肝肿瘤的IER5基因对照射比较敏感，而人肺与脑肿瘤的IER5基因不敏感。结论IER5基因有可能成为宫颈癌与肝肿瘤新的辐射损伤生物分子的一个标记物，对肝肿瘤放疗具有潜在的应用价值。; 丁库克沈晶晶许莉莉李延玲周萍马斌荣赵增强隋建丽周平坤; 关键词：照射 HELA细胞

HIV-1 Tat通过抑制启动子活性调控MCAK基因表达被引量：1: 2010年; 目的验证HIV-1Tat对有丝分裂着丝点关联驱动蛋白MCAK基因表达的调节作用并探讨其分子机制。方法利用表达Tat的人横纹肌肉瘤细胞(TE671)模型及原核表达纯化的Tat蛋白,通过Northern印迹法和蛋白印迹技术验证HIV-1 Tat对MCAK基因表达的抑制作用。PCR扩增MCAK基因各启动区片段,与荧光素酶报告质粒相连接,并转染到TE671细胞,通过荧光素活性分析法检测DNA片段启动活性,确定MCAK基因的活性启动区域。进一步通过HIV-1Tat与MCAK启动区作用,分析Tat对启动子活性的调控作用。结果Northern印迹和蛋白印迹结果证实Tat蛋白对MCAK转录、翻译水平的表达都有强烈的抑制作用;荧光报告质粒检测系统分析表明MCAK的核心启动区存在于-399～+1bp区域,且其启动子活性在Tat存在的情况下受到明显的抑制。结论HIV-1 Tat能作用于MCAK基因启动区-399～+1bp区域,导致MCAK启动子活性降低,从而抑制MCAK基因的表达。; 黄越承孙薏张士猛徐勤枝周平坤蔡建明; 关键词：TAT MCAK 启动子活性

河南HIV感染者的HIV-1 B型株tat基因的克隆及序列分析: 2005年; 克隆河南人免疫缺陷病毒(HIV)感染者HIV-1B型株tat基因完整编码框序列,并分析比较其编码产物的序列结构特点。使用重叠PCR技术,从河南省1名HIV-1感染者外周血标本中扩增出tat基因第一和第二外显子并重组为完整的tat基因序列。获得的HIV-1B病毒株tat基因,第一外显子为263bp,第二外显子为214bp。将该基因编码产物与其他HIV-1株Tat蛋白经DNA软件编辑并翻译成蛋白质,使用ClustalX1.81进行多序列对比分析发现,第一外显子编码产物的3个保守区域的氨基酸组成大致相同,只有少数氨基酸存在差异。由于Tat蛋白不同病毒株间有高度保守的Cys富集区、核心区和碱性氨基酸富集区,tat基因的克隆为研究其功能并以其为靶点设计和筛选抗艾滋病的药物奠定了基础。; 孙薏徐勤枝李敬云隋建丽李韩平吴松峰周平坤; 关键词：HIV-1 第二外显子 TAT蛋白碱性氨基酸富集区

HIV-1 Tat对细胞周期蛋白的影响: 2011年; 目的研究HIV-1 Tat对细胞周期蛋白(cyclinB1)的影响。方法利用人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)细胞系;通过Western印迹检测辐射前后CyclinB1表达变化;使用Northern-Blot及半定量RT-PCR,分析cyclinB1在mRNA水平表达;放线菌酮阻断蛋白合成实验及免疫共沉淀实验检测cyclinB1的稳定性。结果细胞在接受电离辐射和未接受照射情况下,cyclin B1的表达在转染tat基因细胞中明显增强,Tat蛋白不影响cyclinB1在mRNA水平的表达;放线菌酮阻断蛋白合成实验及Tat蛋白诱导细胞电离辐射后泛素化实验均表明,cyclinB1表达水平的增强主要发生在蛋白质合成后的修饰。结论 HIV-1 Tat蛋白能提高Cyclin B1的稳定性,降低CyclinB1泛素化水平;该项研究也许有助于利用分子生物学手段,干预Tat蛋白的表达以调控CyclinB1及相关蛋白的表达,进而改变肿瘤细胞周期的进程,影响临床的疗效。; 孙薏匡红张聪呼永河陈健冯怀志李硕黄越承周平坤; 关键词：HIV-1 TAT 细胞周期蛋白

An Improved Strategy for Efficient Expression and Purification of Soluble HIV-1 Tat Protein in E.coli被引量：2: 2009年; Although the endogenous function of Tat has been elucidated in the past twenty years, the study of its exogenous activity has been hampered due to the difficulty of large scale preparation of the active Tat protein. To express the full-length Tat protein in E.coli, the tat gene was cloned from an HIV infected patient by overlapping PCR. Rare codon usage analysis showed that rare E.coli codons, especially consecutive rare codons for Arg, account for 14% (14 of 101) rare E.coli codons in the tat gene. The expression of the HIV-1 tat gene was verified to be very poor in strain BL21 (DE3) due to the abundance of rare codons; however, tat gene expression was found to be very efficient in the host strain of Rosetta-gami B (DE3), which was supplemented with six rare tRNAs for Arg, Leu, Ile and Pro. Subsequent purification revealed that the proteins are soluble and unusually, the tagged Tat can form dimers independent of cystine disulfide bonds. The purity, integrity and molecular weight of the Tat protein were demonstrated by MALDI-TOF mass spectrometry. Reporter gene activating assay was further confirmed by investigating the transactivation activity of the recombinant Tat protein. Our improved strategy for efficient high level expression and purification of soluble Tat protein has paved the way to fully investigate its exogenous function.; Shi-meng ZHANGRong FANTian-yi YANGYi SUNJing-yun LIQin-zhi XUPing-kun ZHOU; 关键词：大肠杆菌基因 TAT蛋白稀有密码子密码子使用

HIV-1 Tat蛋白抑制DNA修复和增强细胞辐射敏感性被引量：1: 2006年; 近年来临床研究发现,艾滋病合并肿瘤患者放疗后产生的正常组织和皮肤毒性反应明显高于普通肿瘤患者.本研究将探讨HIV-1Tat蛋白是否影响细胞对电离辐射敏感性及机理.两个表达Tat蛋白的细胞系TT2和TE671-Tat均来源于人的横纹肌肉瘤细胞(TE671)并已转染了不同来源的tat基因.使用细胞辐射后克隆形成率检测辐射敏感性,RT-PCR和Western印迹检测基因表达,彗星电泳和γ-H2AX位点检测DNA双链断裂和修复.TT2和TE671-Tat细胞的辐射敏感性与转染空载体及对照细胞相比明显增加.彗星电泳和γ-H2AX位点检测表明,在表达Tat蛋白的细胞中,辐射诱导DNA双链断裂的修复水平明显降低.通过RT-PCR和Western印迹检测进一步证实,表达Tat蛋白的细胞中DNA修复蛋白DNA-PKcs的表达被抑制.HIV-1Tat蛋白抑制DNA-PKcs的表达,降低DNA双链断裂的修复,使细胞的电离辐射敏感性增高.本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性变化提供了重要信息.; 孙薏黄越承徐勤枝王会平隋建丽周平坤; 关键词：HIV-1 TAT DNA-PKCS DNA修复

HIV-1 Tat蛋白对细胞周期相关基因表达及辐射细胞周期阻滞的影响被引量：6: 2006年; 目的:探讨H IV-1 Tat蛋白对细胞周期相关基因表达以及电离辐射诱发细胞周期阻滞的影响。方法:使用包含102个与DNA损伤修复和细胞周期相关的基因微阵列检测人横纹肌肉瘤细胞(TE671)及已转染tat基因的TE671细胞(TT2)基因表达谱的改变;使用流式细胞仪检测细胞周期变化;W estern印迹检测蛋白表达变化。结果:在基因芯片的检测中发现,与DNA损伤修复及细胞周期调控相关的6个基因Cdc25C,K IF2C,Cdc20,DNA-PKcs,CTS1,W ee1在转染tat基因的细胞中表达下调;细胞周期检测发现TE671细胞和TT2细胞经4 Gyγ射线照射后表现出不同程度的G2/M期阻滞,但表达Tat的TT2细胞G2/M阻滞出现较TE671细胞晚,而在照射后48 h时TE671细胞G2/M期阻滞已恢复,但TT2细胞阻滞仍很显著。另外,TT2细胞S期阻滞时间延长。研究进一步发现细胞周期蛋白(cyc lin)B1在TT2细胞中表达增强。结论:H IV-1Tat蛋白导致G2/M检验点功能紊乱,将影响细胞的辐射敏感性,本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性提供了重要实验数据。; 孙薏黄越承徐勤枝王会平隋建丽周平坤; 关键词：HIV-1 TAT 细胞周期细胞周期蛋白B1

HIV-1 Tat调控MCAK基因启动子活性及作用位点的鉴定: 2011年; 目的研究HIV-1 Tat对MCAK启动子活性及基因表达的抑制作用,并鉴定Tat与MCAK启动子的作用位点。方法利用原核表达的Tat蛋白处理A549细胞,通过Western印迹技术验证HIV-1Tat对MCAK基因表达的抑制作用;构建MCAK启动子-荧光素酶载体,转染A549细胞,通过荧光素酶活性分析Tat对启动子活性的调控作用;运用染色质免疫沉淀法(CHIP)分析Tat与MCAK启动区的相互作用,并进一步通过凝胶阻滞实验(EMSA)确定Tat与MCAK启动区的结合位点。结果 Western印迹实验证实Tat对MCAK表达具有强烈的抑制作用;荧光报告质粒检测系统分析表明在Tat存在的情况下,MCAK的核心启动子活性受到明显的抑制,其效应具有明显的剂量依赖性;CHIP和EMSA实验确定Tat蛋白与MCAK基因启动子区的直接相互作用,MCAK基因-337～-232区域存在Tat蛋白的结合位点。结论 HIV-1 Tat对MCAK基因表达具有强烈的抑制作用,并与Tat蛋白结合于MCAK启动区-337～-232区域,从而导致MCAK启动子活性降低有关。; 孙薏周平坤呼永河张聪陈健匡红冯怀志李硕黄越承; 关键词：HIV-1 TAT MCAK 染色质免疫沉淀

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