乙型肝炎（乙肝）病毒（ hepatitis B virus,HBV）感染是目前最为严重的公共卫生问题之一。世界卫生组织（ World Health Organization,WHO）估计全世界目前约有20亿人感染HBV,其中2.4亿以上为慢性感染,每年新增 HBV 感染约500万例,每年有超过78万人死于急性或慢性乙肝[1-2]。中国是HBV感染的中高流行区,近年来已经通过乙肝疫苗的广泛接种有效地控制了HBV的传播,2006年全国乙肝血清流行病学调查结果显示：1~59岁人群乙肝表面抗原（HBsAg）携带率为7.18%,15岁以下儿童 HBsAg携带率为2.08%,与1992年调查结果相比,我国1~59岁人群乙肝表面抗原（HBsAg）阳性率下降了2.5个百分点,15岁以下儿童下降了7~8个百分点。然而,由于我国人口基数大,因此仍存在庞大的感染群体,据卫生部疾病预防控制局估计,至2006年,全国约有9300万人长期携带HBV,其中慢性乙肝患者约2000万[3]。 HBV感染严重危害了人类的健康,同时也引发了一系列社会和经济方面的问题,是现阶段最为突出的公共卫生问题之一。目前,临床上应用的治疗乙肝的药物包括干扰素、核苷类似物等,然而现有的治疗方法多价格高昂,且无法治愈慢性乙肝、解除患者痛苦,常伴有严重的副作用,并可能诱导HBV突变体产生,且停药后反跳现象较高,因此乙肝疫苗的预防接种是目前最为有效的控制乙肝手段。
目的对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行适用性验证及应用。方法对Taq Man MGB探针实时定量PCR检测Vero细胞残余DNA的方法进行特异性、灵敏度、精密性、准确性验证,并应用该方法检测3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液、纯化液和原液中Vero细胞残余DNA含量,计算Vero细胞残余DNA去除率。结果 Taq Man MGB探针实时定量PCR能够特异性扩增Vero细胞基因组DNA长串连重复序列;DNA浓度在10-1~10-6 ng/μl范围内标准曲线线性良好,相关系数为0.996,扩增效率为93.54%;检测灵敏度为10-6 ng/μl,高于斑点杂交法;检测高（10-2 ng/μl）、中（10-4 ng/μl）、低（10-6 ng/μl）浓度阳性对照DNA模板的试验内变异系数（CV）为0.145%~3.110%,试验间CV为0.624%~2.359%;检测不同浓度阳性对照DNA的回收率在101.5%~109.4%之间,均在定量方法可接受的回收率范围内;在斑点杂交检测灵敏度范围内,同一样品采用Taq Man MGB探针实时定量PCR法与斑点杂交法半定量检测的结果吻合。3批次脊髓灰质炎病毒浓缩液纯化后可有效去除Vero细胞残余DNA,总去除率约为100%。结论 Taq Man探针实时定量PCR法特异性、精密性、准确性良好,灵敏度高,可作为斑点杂交法的替代方法,用于实验室内部的质量控制。
