重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心
- 作品数：50 被引量：80H指数：5
- 相关作者：武卫华王立娟冉丹霞石海鹏孙菱更多>>
- 相关机构：西安交通大学医学院第三军医大学大坪医院野战外科研究所第三军医大学高原军事医学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金重庆市教育委员会科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- RNA编辑酶ADAR1在Huh7.5.1细胞中抑制HCV复制的研究
- 2018年
- 目的:探究干扰素在Huh7.5.1细胞中对RNA编辑酶(adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1)表达的影响,以及ADAR1对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)复制的调控作用。方法:干扰素(IFN-α,30 IU/m L)刺激Huh7.5.1细胞后,利用real-time PCR和Western blot检测ADAR1表达水平的变化,同时HCV以一定滴度(0.2 MOI)感染Huh7.5.1细胞,观察IFN-α对HCV复制的影响;利用si RNA降低ADAR1表达,过表达质粒(ADAR1 p110和p150)增加ADAR1表达,并进一步利用基因编辑技术建立ADAR1稳定敲除细胞株,明确ADAR1与HCV的复制关系。结果:IFN-α诱导Huh7.5.1细胞ADAR1 p150表达(48 h:t=10.400,P=0.007;72 h:t=19.390,P=0.002),而不影响ADAR1 p110表达(48 h:t=0.806,P=0.472;72 h:t=1.929,P=0.133),同时IFN-α可显著抑制HCV复制(48 h:t=10.170,P=0.001;72 h:t=35.810,P=0.000)。ADAR1 p110和p150过表达48 h后,HCV病毒核酸和蛋白水平均明显低于空白对照(P=0.004,P=0.015);ADAR1 si RNA干扰后,HCV复制增加了2倍以上,差异显著(t=13.530,P=0.000);利用Crispr-cas9技术敲除掉Huh7.5.1中的ADAR1后,HCV复制也明显增加(t=5.259,P=0.023);ADAR1干扰后IFN-α仍然存在对HCV明显的抑制作用(t=9.146,P=0.001)。结论:IFN诱导蛋白ADAR1可以抑制HCV复制,且ADAR1部分介导了IFN-α对HCV复制的抑制。
- 袁琳杨生永胡源胡接力段晓琼林温育黄爱龙涂增
- HBc蛋白与NIRF蛋白细胞外相互作用鉴定被引量：2
- 2012年
- 构建原核表达质粒pGST-HBc,真核表达质粒pFLAG-NIRF,表达并纯化GST-HBc蛋白,表达FLAG-NIRF蛋白,利用GST pull down技术鉴定HBc与NIRF蛋白的相互作用。利用PCR技术分别扩增HBc编码框和NIRF基因全长,并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体p3*FLAG-CMV-10中,构建出pGST-HBc及pFLAG-NIRF。pFLAG-NIRF转染HEK293,培养48 h,收获前10 h加入MG132抑制蛋白酶体,收获细胞,经NP40裂解后离心收集上清pGST-HBc转化BL21(DE3)细菌,优化培养条件使GST-HBc在上清中大量表达,然后用GST4Bgel亲合纯化该蛋白,结合有GST-HBc蛋白与含FLAG-NIRF的细胞上清孵育后,离心收集GST 4Bgel,经洗脱液洗脱后蛋白电泳,western blotting分析。构建了pGST-HBc及pFLAG-NIRF,在上清中成功表达GST-HBc并纯化该蛋白,在细胞中成功表达FLAG-NIRF,GST pull down结果显示两者存在体外相互结合。HBc与NIRF能够在细胞外发生相互结合。
- 杨艳金方敏白露王筱绘段昌柱
- 关键词：HBC相互作用GSTPULL
- 基于酵母双杂交技术的PRR11相互作用蛋白筛选与初步分析被引量：1
- 2019年
- 目的:采用酵母双杂交技术,筛选PRR11的相互作用蛋白,为深入研究其分子行为机制奠定基础。方法:构建用于酵母双杂交筛选的PRR11诱饵质粒并检测其自激活作用,根据结果进一步构建突变体获得具有较低自激活作用的突变体。对人胎脑cDNA文库进行筛选,获得初始阳性克隆。通过LacZ报告基因检测、回转验证、阳性克隆测序及BLAST序列比对分析,排除假阳性克隆和重复克隆,确定PRR11的候选相互作用蛋白。结果:PRR11具有自激活作用,构建了一个较低自激活作用的PRR11突变体。通过酵母双杂交筛选,获得102个初始阳性克隆转化子。经LacZ报告基因检测,将阳性克隆锁定至39个。通过测序和序列比对分析,证实这39个克隆属于编码15种不同蛋白的基因。最终有RNF41等4个蛋白通过回转验证。结论:RNF41、SCG5、BCYRN1和PRR13是PRR11的潜在相互作用蛋白。
- 余淋丽张莲张春冬卜友泉
- 关键词：酵母双杂交蛋白相互作用
- 诺帝对CasKi细胞增殖及中心体Aurora-A和γ-tubulin基因表达的影响
- 2011年
- 目的探讨诺帝对CasKi细胞增殖、细胞周期及中心体Aurora-A、γ-tubulin和P53蛋白表达的影响及其作用机制。方法用不同浓度的诺帝处理CasKi细胞,MTT法检测细胞增殖活力,流式细胞术分析细胞周期,间接免疫荧光检测中心体的变化,RT-PCR检测细胞Aurora-A基因mRNA的表达,Western blot法检测细胞γ-tubulin、Aurora-A和P53蛋白的表达。结果诺帝能明显抑制CasKi细胞增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,且呈明显的剂量和时间依赖性;细胞中心体内γ-tubulin荧光信号明显减弱,Aurora-A基因mRNA的表达量及γ-tubulin和Aurora-A蛋白的表达量明显下降,而P53蛋白的表达量明显升高,且呈剂量依赖性。结论诺帝可能通过下调Aurora-A,上调P53,发挥其抑制CasKi细胞增殖、阻滞细胞周期,并阻止中心体扩增,限制细胞无序增殖的作用。
- 巫静娴赵涌卞修武
- 关键词：诺帝细胞增殖中心体AURORA-AΓ-TUBULIN
- 人MCPH1基因重组慢病毒的制备及稳定感染HeLa细胞系的建立
- 2014年
- 目的 :构建人MCPH1(microcephalin 1)基因重组慢病毒载体并建立稳定过表达MCPH1基因的宫颈癌HeLa细胞株。方法:将MCPH1基因重组到pLenO-DCE质粒中,构建重组质粒pLenO-DCE-MCPH1,经酶切和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装重组慢病毒,滴度测定后,感染HeLa细胞,用有限稀释法筛选稳定的细胞克隆,real-time PCR和Western blot分别检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白水平。结果:经酶切和测序鉴定,成功构建MCPH1重组慢病毒载体,并成功包装慢病毒,滴度为1.24×109 TU/ml;慢病毒感染HeLa细胞后经有限稀释法成功筛选到MCPH1稳定表达细胞株pLenO-DCEMCPH1-HeLa;real-time PCR证实pLenO-DCE-MCPH1-HeLa细胞株较正常组HeLa(P=0.000)和pLenO-DCE-HeLa组(P=0.000)的MCPH1 mRNA水平显著地增高;Western blot进一步证实pLenO-DCE-MCPH1-HeLa细胞株过表达MCPH1。结论:成功构建MCPH1重组慢病毒,并建立了稳定表达MCPH1基因的细胞株pLenO-DCE-MCPH1-HeLa,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。
- 麦力张冀刘革力卜友泉李韵樊建军宋方洲
- 关键词：慢病毒宫颈肿瘤
- 乳酸链球菌素对乳酸菌抑菌作用的研究
- 采用试管稀释法和纸片扩散法检测nisin对乳酸菌的抑菌浓度,并根据测试菌的0D600作出生长曲线,以研究nisin对乳酸菌的抑菌效果。结果表明:nisin对乳品工业常用乳酸菌具有较强的抑菌作用,仅某些乳酸乳球菌对nisi...
- 贺松龚芳红张德纯郭亚楠
- 关键词：乳酸链球菌素乳酸菌抑菌作用食品级载体
- 文献传递
- 产肠毒素大肠杆菌K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素b亚单位的原核表达及其鼻腔免疫效果被引量：1
- 2012年
- 目的原核表达产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88菌毛蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)b亚单位(LTb),并评价其鼻腔免疫效果。方法采用PCR技术分别扩增不含信号肽的K88和LTb基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达的重组K88和LTb蛋白纯化、复性后,进行SDS-PAGE分析。分别用K88单独、K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠,以生理盐水作为对照,每次间隔1周,共4次,末次免疫后10 d,分离血清,并收集鼻腔和小肠黏膜冲洗液,间接ELISA法检测各组血清特异性IgG和黏膜sIgA抗体水平。结果重组表达质粒pQE30-K88和pQE30-LTb经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组K88和LTb蛋白相对分子质量分别为28 100和12 500,表达量分别约占菌体总蛋白的35%和40%,主要以包涵体形式存在;纯化复性后的重组蛋白纯度均可达95%以上。K88联合LTb滴鼻免疫组血清特异性IgG及鼻腔、小肠黏膜冲洗液中特异性SIgA水平均较K88单独免疫组和对照组明显增高,且差异有统计学意义(P<0.01)。结论在大肠杆菌中高效表达并纯化了重组K88和LTb蛋白,K88联合LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后,可增强特异性血清抗体反应,且诱导了黏膜免疫应答,为将来开发新型的ETEC基因工程疫苗奠定了基础。
- 姜柯安贺志良宋方洲马永平
- 关键词：产肠毒素大肠杆菌原核细胞黏膜免疫
- HBx通过HIPPO信号通路导致小鼠肝癌的发生机制被引量：2
- 2020年
- 目的观察HIPPO信号通路在小鼠感染乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus X,HBx)不同时间的变化,初步探讨HBx导致肝癌发生的机制。方法将转染HBx的肝前体细胞通过门静脉注射入小鼠体内,构建能稳定表达HBx的动物模型,分别于30、90、180、360 d取肝脏组织,HE染色观察肝脏组织病理特征,RT-PCR、Western blot以及免疫组化法检测肝脏组织中HBx的表达,RT-PCR检测HIPPO信号通路相关因子MST1、YAP1 mRNA的表达,Western blot检测MST1、YAP1、p-MST1、p-YAP1蛋白的表达。结果成功构建能在小鼠肝脏中稳定表达HBx的动物模型并发展为肝癌,Western blot结果显示,与对照组相比,HBx组小鼠肝脏组织在术后30 d即出现MST1表达下调,p-MST1表达上调(P<0.01);YAP1表达上调,p-YAP1表达下调(P<0.05),RT-PCR与Western blot结果一致。这种改变一直持续至肿瘤发生。结论HBx可以导致小鼠肝癌发生,其机制可能与长期影响HIPPO信号通路的表达有关。
- 张思遥黄欣王薛杜彬毋楠周梦瑶冯涛
- 关键词：HBX动物模型肝癌
- 重组疫苗E.coli LLO/OVA诱导树突状细胞成熟并表达趋化因子及受体
- 2009年
- 目的:探讨重组疫苗E.coliLLO/OVA诱导树突状细胞成熟和表达趋化因子及其受体的作用.方法:采用基因芯片杂交及RT-PCR检测经E.coliLLO/OVA刺激后小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)的NF-κB信号通路相关分子和趋化因子及其受体mRNA的表达,流式细胞分析BMDC活化状况及趋化因子受体CXCR4的表达.结果:未成熟BMDC表达趋化因子基因Ccl2,Ccl4,Ccl6,Ccl9,Ccl17,Ccl22,Cxcl2,Cxcl4和趋化因子受体基因Ccr2,Ccr5和Ccr7.经E.coliLLO/OVA刺激后4～8 h,BMDC明显上调表达基因Myd88,Nf-κb1,Ccl3,Ccl5,Ccl7,Ccl22,Cxcl1,Cxcl9和Ccr12,同时下调表达趋化因子受体基因Ccr2和Ccr5,但持续表达Ccr7.经该疫苗刺激后8 h,BMDC上调表达基因Tlr2,Myd88,Nf-κb1和Cxcr4.该疫苗刺激后12 h,BMDC下调一系列趋化因子和趋化因子受体基因表达,仅持续表达基因Ccl5和Cxcr4.经疫苗刺激24 h后BMDC上调表达CD40,CD80,CD86,MHC-II类分子及CXCR4.结论:重组疫苗E.coliLLO/OVA可能通过Myd88/NF-κB信号途径诱导了小鼠骨髓树突状细胞成熟并表达一系列趋化因子及趋化因子受体基因,尤其上调了趋化因子受体CXCR4的表达.
- 徐曼徐光绪王渝琦戴明燊
- 关键词：趋化因子趋化因子受体
- 京尼平、维生素E对非酒精性脂肪肝体外模型中解耦联蛋白2及相关因子表达的影响被引量：9
- 2010年
- 本实验旨在探讨京尼平和维生素E对非酒精性脂肪肝的作用机理。采用软脂酸诱导L02细胞脂肪变性,建立非酒精性脂肪肝体外模型,用维生素E(VitE)、京尼平及两者合用干预72 h,观察L02细胞脂变程度、线粒体膜电位变化、检测解耦联蛋白2(UCP2)mRNA表达,UCP2、NF-κB和TNF-α蛋白水平表达,以及细胞上清生化水平。结果显示,京尼平和VitE两者合用时肝细胞脂变明显改善,线粒体跨膜电位升高,UCP2的mRNA和UCP2、NF-κB、TNF-α蛋白表达下调(P<0.05),细胞上清中TG、GGT、AST、ALT及MOD含量降低(P<0.05),SOD活力升高(P<0.05)。VitE与京尼平联合应用能显著缓解肝细胞脂肪变性。
- 刘琳管小琴王立娟唐袁婷
- 关键词：脂肪肝京尼平维生素E解耦联蛋白2核因子-ΚB
