目的:获得尘螨变应原第6组分Der f 6原核表达产物并检测其与尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体IgE结合率。方法:酶切质粒p ET28a(+)-Der f 6获得目的基因Der f 6,将其与p ET32a(+)载体连接成质粒p ET32a(+)-Der f 6,转化BL21细菌后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni+离子亲和层析柱纯化表达产物,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹实验(Western blot)和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定纯化产物。以纯化获得的产物为包被抗原建立间接ELISA法检测尘螨过敏性哮喘患儿血清抗体反应情况。结果:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)-Der f 6,将该质粒转化E.coli BL21诱导表达,亲和层析纯化后,SDS-PAGE显示获得目的蛋白,Western blot验证其能够与载体的组氨酸标签结合,质谱鉴定其Der f 6结构一致。以此产物为包被抗原建立间接ELISA检测尘螨过敏性哮喘患儿血清,阳性率为41.3%(19/46)。结论:成功构建了原核表达质粒p ET32a(+)-Der f 6,亲和纯化获得的目的蛋白具有良好的反应原性。
目的克隆粉尘螨变应原Der f Mal f 6(简称Mal f 6)编码基因并构建其原核表达体系。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank中的(AY283280.1)序列设计并合成引物,RT-PCR扩增Der f Mal f 6全长基因,克隆至pColdTF DNA载体,转化至E.coli JM109,取阳性克隆测序;将pCold TF-Mal f 6质粒转化至BL21,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE验证表达产物,采用生物信息学软件预测Mal f 6的理化特性、结构和功能。结果 RT-PCR获得全长为495bp的Mal f 6基因。原核表达后经SDS-PAGE电泳显示其全细胞、上清及沉淀物均有蛋白表达,以上清表达量较高。生物信息学分析该蛋白由164个氨基酸组成,分子质量单位为17.7ku,二级结构由α螺旋(4.88%)、延伸主链(37.8%)和无规则卷曲(57.32%)组成,是亲水性细胞质蛋白,具有肽酰-脯氨酰反式异构酶活性。结论粉尘螨变应原Mal f 6原核表达获得成功,为该变应原的进一步研究及规模生产和应用奠定了基础。
目的:克隆表达粉尘螨变应原第7组分(简称Der f 7)重组蛋白,制备抗Der f 7单克隆抗体,并进行鉴定。方法:用p ET28a(+)-Der f 7原核表达体系表达Der f 7重组蛋白,以此免疫BALB/c小鼠,将骨髓瘤细胞和脾细胞融合,经ELISA法筛选杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔,获得腹水,经蛋白A琼脂糖介质纯化,后鉴定抗体的效价、纯度,采用免疫印迹法鉴定抗体的特异性。结果:获得三株稳定分泌重组Der f 7单克隆抗体的杂交瘤细胞,产生的抗体纯度高,效价高于1∶243 000。Western blot显示能很好地识别Der f 7重组蛋白。为Der f 7变应原的定量、定位及相关过敏性疾病的诊疗奠定基础。结论:成功获得粉尘螨变应原第7组分(Der f7)重组蛋白单克隆抗体,且抗体效价纯度及特异性较好。
