许文明
- 作品数：8 被引量：26H指数：2
- 供职机构：四川大学华西医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建
- 2004年
- 目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA ,构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3 Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA ,采用RT -PCR技术扩增Sox5cDNA片段 ,并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒 ,双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT -PCR获得 1 1kb的产物 ,连接重组后经双酶切筛选阳性克隆 ,DNA测序验证 ,确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体 ,为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF2 3 0的转录调控打下了基础。
- 许文明张思仲何国平
- 关键词：RT-PCR基因克隆转录调控
- 短发夹RNA介导RNA干扰的时间和剂量效应研究被引量：20
- 2005年
- 用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术抑制哺乳动物细胞中外源报告基因的表达,以探讨该过程中RNAi作用的剂量和时间效应.应用Lipofectamine 2000将外源报告基因的表达载体与编码短发夹RNA(shorthairpin RNA,shRNA)的质粒共转染HEK293H细胞,观察shRNA载体对报告基因的抑制效应.转染后,shRNAs的瞬时表达可特异地抑制细胞内报告基因的表达.在共转染后12,24,48,60,72,96 h时检测EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)基因mRNA及蛋白质表达水平,结果显示,EGFPmRNA及蛋白质表达在12 h时略有降低,24～48 h时表达逐渐降低,48～72 h时降低最明显,其后EGFP表达水平逐渐恢复.提示该过程中RNAi效应呈现由弱到强、又由强到弱的逐渐消逝趋势.共转染一系列剂量比例的EGFP干扰载体与靶载体的结果表明,在一定剂量范围内,RNA干扰载体所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关,当其剂量进一步加大足以抑制外源基因表达时,抑制效应则维持在一'平台期'.此外,通过RNAi抑制HeLa细胞、HEK293细胞中荧光素酶基因的表达,荧光素酶活性变化也表现出上述类似的效应.这些结果表明,在体外哺乳动物细胞中,基于表达载体的RNAi作用呈现剂量和时间依赖性效应.这为基于载体表达的RNAi技术应用研究提供了一定的理论参考及依据.
- 何国平张思仲王英成肖翠英马用信许文明丁兰陶大昌孙岩陈玉娟
- 关键词：RNA干扰短发夹RNA报告基因共转染
- ZNF230/荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在Cos细胞中的表达与定位被引量：4
- 2004年
- 为了用绿色荧光蛋白标记观察人类无精症相关基因ZNF230在Cos7细胞中的蛋白质表达及定位,用PCR方法扩增得到突变的人和小鼠mt ZNF230和mt znf230基因,使其3′端的终止密码TGA突变为TGG,并装入T 载体,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP N1的绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)基因融合,构建了ZNF230—荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入Cos7细胞系。荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP N1转染的Cos细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP ZNF230和pEGFP znf230的Cos细胞中荧光主要聚集在细胞核中。表明转染的Cos细胞系能高效表达人ZNF230和小鼠znf230蛋白,ZNF230基因表达的蛋白定位于细胞核内。
- 许文明张思仲邱为民何国平刘运强马用信孙岩
- 关键词：绿色荧光蛋白COS细胞
- 泛素连接酶Huwe1调控proNGF/p75NTR介导猴脑缺血再灌注损伤
- <正>目的神经细胞凋亡是缺血性脑卒中的主要病理机制之一。p75神经营养因子受体(p75NTR)诱导凋亡与,JNK—p53-BAX通路有关,而p53是泛素连接酶Huwe1的底物。近来有研究发现神经营养因子前体(proNGF...
- 余丽华何国倩陈宁许文明何俐
- 文献传递
- 人受精促进肽受体(TCPllc)基因的克隆、表达及选择性剪接
- 2003年
- 目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCPll基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCPlla同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入pGEM-T easy载体并测序;采用BLAST、ClustalW及RT-PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT-PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCPlla、b相比,在基因组的5′-端存在复杂的外显子剪接现象。RT-PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肽受体TCPll基因1个新的转录本TCPllc, 结合mTcp-11的功能提示,TCPll基因a、b、c这3种转录本对精子发生和人受精过程可能起重要作用。
- 马用信张思仲吴洽庆孙岩邱为民许文明
- 关键词：克隆
- 短发夹RNA介导RNA干涉的实验学控制研究
- 2005年
- 采用载体介导的RNA干涉 (RNA interference,RNAi)技术抑制HEK293H细胞中外源报告基因的表达,并设置一系列的实验学控制以探讨其在RNAi应用研究中的价值及意义.运用pAVU6+27,构建了针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的一系列短发夹RNA表达载体,并用脂质体法转染于HEK293H细胞中,检测EGFP mRNA及蛋白表达水平.瞬时转染48h后, RT-PCR及Western blot结果表明,针对EGFP三个靶点的干涉质粒均不同程度地抑制细胞内EGFP的表达,但仅转录正反义链、链内1-2个碱基错配的干涉载体不能介导特异的RNAi效应.此外,共转染实验结果表明干涉质粒两两间无相互增强或抑制的RNAi效应.在此基础上,通过G418筛选生成了HEK293H EGFP稳定表达株,在转染后不同时间点检测EGFP mRNA及蛋白表达变化,发现RNAi 效应在一定时间范围内呈现明显的时间依赖性.这些结果表明,有效的实验控制在RNAi研究中十分必要,具有重要的参考价值.基于载体表达的RNAi作用呈现明显的时间依赖性效应,为RNAi应用研究提供了一定的参考及借鉴价值.
- 何国平张思仲马用信肖翠英许文明孙岩丁兰张炜陶大昌陈玉娟
- 关键词：短发夹RNA介导EGFPRNA干涉碱基错配
- 泛素连接酶Huwe1调控proNGF/p75NTR介导猴脑缺血再灌注损伤
- 目的 神经细胞凋亡是缺血性脑卒中的主要病理机制之一.p75神经营养因子受体(p75NTR)诱导凋亡与JNK-p53-BAX通路有关,而p53是泛素连接酶Huwe1的底物.近来有研究发现神经营养因子前体(proNGF)与p...
- 余丽华何国倩陈宁许文明何俐
- 人类生精的相关基因被引量：2
- 2004年
- 遗传因素在男性的生精过程中起重要作用。目前大多数的研究以小鼠为模型。该文以精子发生过程的先后为主线 ,主要阐述通过基因剔除等技术 ,对与生殖相关的一些较重要基因功能的认识 ,并简述目前研究方法的局限性和对未来研究进展的展望。
- 许文明张思仲邱为民
- 关键词：人类遗传学精子发生基因剔除生殖
