刘晓健
- 作品数：57 被引量：108H指数：8
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- 相关领域：农业科学生物学理学机械工程更多>>
- 不同RNAi方法对飞蝗触角高表达基因沉默效率的比较被引量：4
- 2017年
- 【目的】RNAi技术在研究飞蝗功能基因组学方面已经日趋成熟,飞蝗触角中富含有丰富的气味结合蛋白、转运蛋白以及气味降解酶等,这些蛋白在昆虫嗅觉信号传导中发挥着重要的作用,但是关于高效降解这些基因的相关RNAi方法还未知,因此本文通过分析不同RNAi方法对飞蝗触角高表达基因的沉默效率差异变化,以此探索一种高效降解飞蝗触角高表达基因的方法,为后续研究基因功能提供理论依据与技术指导,为从飞蝗嗅觉机制方向设计防控蝗灾的分子靶标奠定基础。【方法】以Lm CYP3117C1基因为目标基因,飞蝗为实验材料,选取飞蝗5龄若虫解剖触角、下颚须、翅、跗足、中肠、马氏管6个组织部位,利用实时荧光定量PCR技术分析基因不同组织部位的表达特异性。用不同溶剂溶解ds RNA(DEPC水,丙酮和DEPC水(1︰1)混合溶剂,0.1%Triton X-100),分别采用注射法(触角窝注射和腹部注射),浸泡法和涂抹法3种方法干扰靶标基因,利用实时荧光定量PCR技术分析基因表达抑制情况,研究不同RNAi方法对基因表达量变化的影响。【结果】Lm CYP3117C1基因在飞蝗若虫6个组织部位均有表达,在触角的表达量最高,分别是下颚须、翅、跗足、中肠、马氏管的3.78倍、2.10倍、10.84倍、363.48倍、365.16倍。通过在两边的触角窝注射ds CYP3117C1,24 h后飞蝗雌雄虫触角Lm CYP3117C1表达量显著降低,雌虫和雄虫沉默效率分别为76.84%和87.51%,但在其他组织部位(下颚须、翅、跗足、其余整虫)基因表达量没有发生显著变化;飞蝗腹部注射ds CYP3117C1,24 h后雌雄虫触角的基因表达水平均发生显著降低,其中雌虫触角沉默效率达68.60%,雄虫沉默效率达61.10%,另外,飞蝗雌虫跗足Lm CYP3117C1基因表达量也发生显著降低,但下颚须、翅和其余整虫没有明显变化;飞蝗雄虫下颚须,其余整虫Lm CYP3117C1基因表达有显著降低,翅和跗足没有发生明�
- 史学凯张艺伟朱坤炎马恩波马恩波刘晓健张建珍
- 关键词：触角RNAI技术浸泡法涂抹法
- 东亚飞蝗几丁质合成酶基因的分子特性及功能研究
- 蝗灾是我国农业历史上的重大自然灾害，东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)是造成蝗灾的主要类群之一。在蝗虫防治工作中，目前仍以有机磷杀虫剂为主要手段，长期施用化学杀虫剂导致一系列...
- 刘晓健
- 关键词：东亚飞蝗几丁质合成酶基因克隆分子特性杀虫剂
- 文献传递
- HR4基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
- 本发明提供一种昆虫HR4基因全长cDNA序列及其dsRNA在害虫防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组数据库中获取序列为SEQ ID NO：1的HR4基因全长cDNA序列。依据SEQ ID NO：1，设计并...
- 刘晓健孙亚文张学尧张建珍马恩波
- 文献传递
- 一种飞蝗透明带基因Piopio及其dsRNA和应用
- 本发明属生物技术领域，具体涉及一种飞蝗透明带基因Piopio及其dsRNA和应用。为提供一种飞蝗防治途径，本发明通过生物信息学方法从飞蝗转录组中获取一种飞蝗透明带基因LmPio的核苷酸序列，进一步通过测序验证并确定其OR...
- 张建珍苏亚芷赵小明刘卫敏刘晓健
- 飞蝗几丁质合成酶2基因的表达特性、功能及调控被引量：18
- 2014年
- 【目的】几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)是昆虫几丁质合成过程中的关键酶之一,由于高等动物不存在该酶,而被认为是设计安全高效杀虫剂的潜在靶标。论文在已克隆得到飞蝗几丁质合成酶2基因cDNA序列(LmCHS2,GenBank登录号:GU067731)的基础上,进一步深入探讨该基因在不同发育时期的表达特性、功能及调控,为基于RNA干扰技术的飞蝗有效控制提供科学依据。【方法】根据已知LmCHS2基因核苷酸序列,设计特异性表达引物,运用RT—qPCR技术研究该基因在卵、若虫及成虫期的表达特性;体外合成LmCHS2的dsRNA后,分别注射至成虫期第1天的雌虫和雄虫,收集第5天的中肠样本提取RNA,反转录成cDNA后,采用RT—qPCR方法检测LmCHS2沉默效果。解剖飞蝗整个肠道后,观察中肠的形态变化及围食膜的完整性,探讨该基因在成虫期的生物学功能;饥饿处理飞蝗不同时间后,再重新进食,观察试虫肠道的变化,进一步运用RT—qPCR技术检测LmCHS2的表达。【结果】LmCHS2在飞蝗卵发育的前期和中期几乎没有可检测到的表达,卵发育后期表达量急剧上升,在4龄、5龄若虫和成虫期稳定表达;分别对羽化后第1天的雌、雄成虫注射dsCHS2,与对照组相比,处理组试虫LmCHS2表达量均显著下降,且取食量明显减少,雌虫和雄虫死亡率分别达78%和85%;解剖消化道后发现,注射dsCHS2后飞蝗中肠几乎不含有食物,中肠和胃盲囊长度显著缩短;对中肠的组织学观察结果表明对照组飞蝗围食膜发育完整,而注射dsCHS2后围食膜被严重破坏甚至缺失;饥饿处理飞蝗48 h后,与对照组相比,饥饿组中肠几乎不合有食物,长度亦显著缩短。H&E染色结果表明,饥饿组围食膜被严重破坏,对照组围食膜结构完整,与RNAi的结果非常相似;重新进食后围食膜发育良好;饥饿处理24 h和48 h后LmCHS2的表达被显著抑制,重新进食0.5 h后,其表达量快速上调,表明进食影响LmCH
- 刘晓健崔淼李大琪张欢欢杨美玲张建珍
- 关键词：飞蝗RNA干扰
- 昆虫表皮发育研究进展及展望被引量：13
- 2019年
- 昆虫体壁(Integument)具有类似高等动物皮肤和骨骼的双重功能,坚硬的表皮限制了躯体生长,因此,虫体生长发育过程中须进行周期性蜕皮。昆虫表皮由皮细胞分泌形成,从外到内可分为外包膜(Envelope)、上表皮(Epicuticle)、外表皮(Exocuticle)、内表皮(Endocuticle)和皮细胞层(Epidermis),外表皮和内表皮统称为原表皮(Procuticle)。脂类物质主要存在于上表皮中,原表皮的主要化学成分为几丁质和蛋白质,在表皮形成过程中上述成分依次分泌并相互作用,最终形成有序排列的表皮结构。近年来基因组学、蛋白质组学、RNA干扰技术等组学及分子生物学技术的快速发展,极大地促进了昆虫表皮发育的研究进展。本文结合近年来该领域研究成果,就表皮结构和成分、表皮脂代谢、表皮几丁质代谢和表皮蛋白等方面的研究进展进行综述,为深入认识昆虫表皮发育机制提供参考,并为害虫防治提供理论依据。
- 刘晓健刘卫敏赵小明张建珍马恩波
- 关键词：表皮脂代谢表皮蛋白
- 飞蝗V-ATPase-V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用
- 本发明公开了飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因及其dsRNA在害虫防治中的应用，飞蝗V‑ATPase‑V1结构域基因包括飞蝗V‑ATPase‑A、V‑ATPase‑B、V‑ATPase‑C、V‑ATPase‑D、V‑A...
- 刘晓健梁晓宇史学凯张建珍
- 文献传递
- 昆虫几丁质合成酶1基因片段及其dsRNA和应用
- 本发明提供一种昆虫几丁质合成酶1的基因片段及其dsRNA的应用，通过对中华稻蝗几丁质合成酶1的克隆和测序，得到核苷酸序列为SEQ ID NO：1的几丁质合成酶基因1，从中选出序列为SEQ ID NO：2的几丁质合成酶基因...
- 张建珍刘晓健马恩波杨美玲郭亚平
- 飞蝗几丁质酶5-1抗体制备及表达特性分析被引量：1
- 2018年
- 【目的】通过制备飞蝗(Locusta migratoria)几丁质酶5-1(LmCht5-1)的多克隆抗体,建立飞蝗体内LmCht5-1蛋白水平检测方法,分析LmCht5-1在4龄飞蝗的表达特性及组织定位。【方法】采用MEGA软件对LmCht5-1和LmCht5-2氨基酸序列进行比对,利用Expression网站对LmCht5-1氨基酸序列进行抗原表位预测分析,获得LmCht5-1抗原结构区域;以飞蝗c DNA为模板,通过PCR扩增LmCht5-1的抗原片段;同时通过酶切连接构建含有鸡血清白蛋白OVA的载体p ET32a-OVA;然后通过酶切连接将LmCht5-1插入到p ET32a-OVA载体构建p ET32a-OVA-LmCht5-1;将p ET32a-OVA-LmCht5-1转入表达菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组蛋白OVA-LmCht5-1;利用Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。通过ELISA方法检测抗体效价;利用Western blot检测抗体特异性。提取4龄飞蝗不同日龄表皮,采用Western blot分析LmCht5-1蛋白表达模式。对4龄飞蝗注射ds LmCht5-1,检测蛋白水平LmCht5-1表达量,并通过免疫组化方法对LmCht5-1进行定位及功能分析。【结果】通过LmCht5-1和LmCht5-2序列比对和抗原表位预测分析,获得LmCht5-1的471—533AA可作为抗原区域;通过酶切连接分别获得p ET32a-OVA和p ET32a-OVA-LmCht5-1。经诱导表达和纯化后获得重组蛋白OVA-LmCht5-1,分子量为71.34 k D;免疫后制备多克隆抗体OVA-LmCht5-1,ELISA检测效价为1﹕102 400。多克隆抗体OVA-LmCht5-1用于Western blot检测时可特异性识别LmCht5-1,与LmCht5-2蛋白无交叉反应。利用Western blot方法检测4龄若虫各日龄表皮中LmCht5-1蛋白的表达,发现LmCht5-1蛋白随发育日龄其表达量逐渐增加,在蜕皮当天达到峰值,蜕皮后快速降至最低点。对飞蝗若虫N4D2注射ds LmCht5-1,检测到在N4D5时,LmCht5-1的转录水平和蛋白水平均被显著抑制,抑制率分别为70.0%和73.6%。选取注射ds LmCht5-1和ds GFP的4龄飞蝗表皮,进行免疫组化实验显示LmCht5-1定位于表皮细胞和旧表皮中,其功能失活�
- 张婷婷柳伟伟高璐李任建付穗业刘晓健李大琪李大琪刘卫敏张建珍
- 关键词：飞蝗抗体制备WESTERNBLOT
- 飞蝗Knickkopf 3-5′基因dsRNA在害虫防治中的应用
- 本发明提供了一种飞蝗Knickkopf 3‑5'基因dsRNA在害虫防治中的应用，其中公开了一种Knickkopf 3‑5'基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示序列；还公开了一种飞蝗Knickkopf 3‑5'...
- 张建珍张睿赵小明刘晓健马恩波
- 文献传递
