目的研制粉尘螨Ⅱ组变应原Der f 2单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),并建立双单抗夹心ELISA检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原Der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接ELISA筛选获得McAb杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心ELISA法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3B12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3G7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心ELISA方法测定Der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/mL,并在6.25ng/mL-300ng/mL范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量为100ng/10000BAU。结论成功制备了高效价抗Der f 2单抗,并建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量,为临床应用奠定基础。
目的 克隆腐食酪螨Tyr p 34基因,表达、纯化出重组蛋白,并鉴定其免疫原性。方法 提取腐食酪螨的总RNA,通过反转录聚合酶链式反应获得其cDNA片段。根据引物和cDNA进行PCR扩增,通过酶切连接构建表达载体pET-28a(+)-Tyr p 34,并将鉴定为阳性的重组表达质粒转入感受态大肠杆菌中。分别在高温及低温条件下,少量诱导表达重组蛋白Tyr p 34以进行蛋白鉴定;大量诱导表达该重组蛋白并采用亲和层析法纯化,将纯化后的目的蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测并进行免疫印迹分析(Western blot)及生物信息学分析。结果 双酶切结果显示Tyr p 34基因与载体成功连接。少量表达后进行蛋白鉴定,显示目的基因在大肠杆菌中成功表达,Tyr p 34蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在,在高温组中含量相对较多。大量表达后纯化的重组Tyr p 34蛋白分子量约为20 kDa。Western blot显示有明显条带,表明该重组基因所表达的蛋白可与腐食酪螨过敏患者的血清反应。生物信息学分析结果显示Tyr p 34基因大小为462 bp,编码153个氨基酸。氨基酸序列与NCBI公布的Tyr p 34氨基酸序列(登录号:ACL36923.1)同源性为99%。Tyr p 34蛋白有5个磷酸化位点,主要由无规则卷曲和α-螺旋构成。结论腐食酪螨Tyr p 34基因成功克隆并表达、纯化出重组蛋白,该蛋白具有免疫原性。通过Tyr p 34的生物信息学分析,有利于深入研究腐食酪螨过敏原的结构和理化性质。
