张利军
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院临床血液学教研室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 抗慢性粒细胞白血病细胞人源化单链抗体的原核表达及其活性被引量：1
- 2012年
- 目的原核表达抗慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)细胞人源化单链抗体(Humanized sin-gle-chain variable fragment,hscFv),并检测其抗原结合活性。方法从重组质粒pUC57-hscFv中扩增hscFv基因,插入含6×His标签的原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-hscFv,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,SDS-PAGE分析其纯度;Western blot分析其反应原性;间接免疫荧光试验检测其抗原结合活性。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约为46 000,表达量约占菌体总蛋白的37%,主要以可溶性形式存在;纯化的重组融合蛋白纯度为94%,可与鼠抗6×His单抗及K562细胞表面抗原特异性结合。结论成功原核表达并纯化了抗CML细胞hscFv,为其进一步应用于CML的临床分子诊断和生物靶向治疗奠定了基础。
- 朱小影王东李身锋张利军钟梁冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病人源化抗体原核细胞
- 抗CML单链免疫毒素载体的构建、表达及活性鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的:构建单链免疫毒素hscFv-ETA'的原核表达载体,经表达后鉴定其对CML细胞的特异性杀伤作用。方法:采用亚克隆技术,首先将hscFv与截短的假单胞菌外毒素基因ETA'通过酶切及连接反应,在载体pWW20上构建hscFvETA'单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pET32a(+)原核表达载体中,转化BL21(DH3)宿主菌,IPTG诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法,Western blot鉴定纯化的目的蛋白,FCM鉴定融合蛋白hscFv-ETA'与细胞结合的活性以及诱导细胞凋亡的能力。结果:限制性酶切图谱和序列分析证实,在pET32a(+)原核表达载体上成功地构建了hscFvETA'单链免疫毒素载体;该基因在pET32a(+)载体中获得高效表达,表达产物的相对分子质量与预期值相符;经Western blot鉴定证实纯化后的重组免疫毒素hscFv-ETA'融合蛋白是正确的;经FCM证实hscFv-ETA'蛋白能特异性结合CML细胞并诱导细胞凋亡。结论:已成功构建并原核表达单链免疫毒素hscFv-ETA',证明该蛋白能发挥特异性结合并诱导CML细胞凋亡。
- 朱小影陶崑李身锋张利军李亚娟王东钟梁冯文莉
- 关键词：慢性粒细胞白血病重组免疫毒素
