方勤美
- 作品数：48 被引量：101H指数：5
- 供职机构：福建省农业科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金福建省科技计划项目福建省科技厅资助项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 嗜水气单胞菌β-hemA重组菌表达产物ISCOMs的研制被引量：16
- 2004年
- 嗜水气单胞菌β-hemA重组菌PCB的培养上清液经硫酸铵梯度沉淀粗提毒素蛋白质，并在pH2．5的柠檬酸缓冲液里酸化处理以暴露其疏水区，经Mega-10裂解后与QuilA结合制备ISCOMMs，电镜下可观察到30～40nm的多面体的笼格状颗粒结构。经鳗鱼的免疫保护试验证实．ISCOMs组(每尾40～80μg)保护率高达100％，同剂量的溶血素+弗氏佐剂组可达62．5％，未加佐剂的溶血素只有50％。
- 方勤美林天龙龚晖杨金先刘晓东
- 关键词：嗜水气单胞菌免疫
- 猪链球菌2型PCR-ELISA检测方法的建立与优化
- 2012年
- 根据已发表的猪链球菌2型的cps2j基因序列,设计合成上游标记生物素的1对引物和1条标记地高辛的特异性探针,建立了该菌的PCR-ELISA检测方法。方法利用PCR仪作为杂交场所,并对几个主要条件参数进行优化,结果显示在鲑鱼精DNA浓度1.6mg·mL-1、变性温度为94℃、变性时间为1min、探针浓度为0.5umol·mL-1、杂交温度55℃、杂交时间1min、一抗作用时间45min、二抗作用时间40min时检测方法敏感性最好,特异性最强。通过对17个阴性样本检测,测得平均值为0.057,方差为0.047,计算得临界值为0.198。
- 方勤美朱继昌池洪树林天龙
- 一种试剂盒和检测猪链球菌2型的方法
- 本发明提供了一种试剂盒和一种猪链球菌2型的检测方法。该试剂盒包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修饰；所述探针的5’端和/或3’端被地高辛修饰；所述上游引物和所述下游引物能...
- 方勤美林天龙朱继昌
- 嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺
- 本发明涉及分子生物学和免疫学领域，特别涉及一种嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺，步骤为：将嗜水气单胞菌菌株培养而得培养液；培养液离心后得上清液，用饱和硫酸铵处理上清液，离心后取沉淀用PBS重悬、透析，获取悬...
- 方勤美龚晖林天龙
- 文献传递
- 嗜水气单胞菌基因工程疫苗研究
- 为了克隆、表达嗜水气单胞菌β-溶血素基因，构建抗嗜水气单胞菌的基因工程疫苗，我们应用PCR技术，扩增了嗜水气单胞菌ML316的β-溶血素基因，命名为AHL316HEM。将PER产物克隆到pGEM-T Easy vecto...
- 林天龙龚晖方勤美董传甫
- 关键词：嗜水气单胞菌ISCOMS基因工程疫苗PCR技术免疫接种
- 文献传递
- 单克隆抗体制备的亲和填料在血浆高丰度蛋白分离中的应用被引量：2
- 2008年
- 分离去除高丰度蛋白成为血浆蛋白质组研究的关键问题之一。从已建株的17株抗人血浆白蛋白单克隆抗体库中选出一株合适抗体。该抗体用Protein G Sepharose 4B吸附,然后用交联剂DMP(庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)使之与Protein G蛋白共价交联。实验结果显示600μl(结合1mg抗体)胶能分离10μl血浆中的白蛋白和球蛋白。填料重复使用10次后吸附能力无显著改变。对填料的吸附蛋白进行MALDI-TOF/TOF鉴定主要为白蛋白和球蛋白及其碎片,但发现吸附的蛋白有转铁蛋白,纤维蛋白原,抗胰蛋白酶,前脂蛋白,Vitamin D结合蛋白,Keratin 10和CD5抗原相似蛋白。实验结果表明该方法能在固定目的抗体的同时最大量地保持抗体活性,该方法有望在蛋白质组学研究的高丰度蛋白分离中得到广泛应用。
- 王云丹宁云山彭丹丹李妍方勤美邓新宇姜颖李明
- 关键词：单克隆抗体高丰度蛋白血浆蛋白质组
- 猪繁殖与呼吸综合征流行病学、病原学与分子诊断技术研究
- 周伦江王隆柏庄向生魏宏方勤美车勇良陈如敬陈少莺吴学敏刘玉涛
- 课题来源与背景：该项目来源:福建省农业科学院,项目编号为B2009-01.猪繁殖与呼吸障碍综合征(PRRS)是由PRRSV引起的一种高度传染性疾病,临床上以母猪发热、厌食、早产、流产、木乃伊胎、死胎、弱仔等繁殖障碍及商品...
- 关键词：
- 关键词：呼吸综合征流行病学病原学诊断
- 表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建被引量：5
- 2007年
- 以PRRSV FJ-1a株为模板，采用RT—PCR法分别扩增出GP2a／GP2b-3，GP3，GP4、GP5和M蛋白基因片段，双酶切后插入穿梭质粒pDC316。利用AdMax^TM法，将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞，得到重组腺病毒Ad—GP2a／GP2b-3、Ad—GP3、Ad—GP4、Ad—GP5和Ad-M。重组腺病毒滴度为10^7.7～10^9.0 TCID50·mL^-1，而以Ad—GP5滴度最低，仅为10^7.7 TCID50·mL^-1。PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性，确证重组病毒均能稳定携带目的基因。对目的基因转录的RT—PCR鉴定结果显示，重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA。表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得，为进一步研制PRRSV基因工程疫苗，解析主要囊膜蛋白功能奠定基础。
- 陈振海林天龙俞伏松宋铁英龚晖方勤美杨金先
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒重组腺病毒囊膜蛋白
- 禽流感病毒T细胞表位与体外重建鸡MHCⅠ类分子结合试验被引量：15
- 2007年
- 为探讨体外重建的MHCⅠ复合体BF2-linker-β2 m鉴定病毒抗原肽系统能否在体外结合抗原多肽,以及不同类的MHCⅠ类分子结合相同和不同抗原多肽表位能力的差异,本研究采用人工合成的禽流感病毒的3条多肽,猪口蹄疫病毒的2条多肽,以及来源于草鱼呼肠孤病毒的2条多肽分别与4类体外重建的串联鸡MHCⅠ类分子复合体BF2-linker-β2 m进行了体外结合试验。BF2-linker-β2 m与不同的病毒抗原九肽按照1∶10的摩尔比进行混合,作用后取反应混合物离心除去未与MHCⅠ类分子结合的抗原多肽;然后取BF2-linker-β2 m分别与抗原多肽形成的复合体,利用酸洗法将结合的多肽自MHCⅠ类分子的抗原多肽结合槽中洗脱,洗脱后的蛋白和多肽混合物离心收集洗脱的多肽溶液,随后利用C18柱对洗脱的多肽进行去盐、脱酸处理;将多肽样品冻干,用基质溶解后直接点样进行一级质谱(MS)和二级质谱(MSMS)测定,结果表明,3类体外重建的BF2-linker-β2 m可与禽流感病毒多肽KILTIYSTV和LLLAIVSLV结合,而不与禽流感病毒多肽TIGECPKYV以及猪口蹄疫病毒和草鱼呼肠孤病毒的4条多肽结合。证实由于MHCⅠ类分子的多态性导致复等位基因的MHCⅠ类分子结合病毒抗原表位的能力存在差异;病毒的T细胞抗原表位是MHCⅠ类分子限制性的;KILTIYSTV和LLLAIVSLV是禽流感病毒的候选表位。
- 李新生陈红英闫若潜高凤山方勤美夏春
- 关键词：MHCT细胞表位质谱
- 一商品猪SLA-Ⅰ分子复合体的体外构建被引量：2
- 2009年
- 【目的】研究中国北方杂交商品猪SLA-Ⅰ类分子结构特点,并为进一步的多肽结合等功能研究奠定基础,需要在体外构建正确折叠的SLA-I类分子复合体。【方法】以长白-达兰商品猪为研究材料,克隆SLA-2和β2m。然后采用剪接重叠延伸PCR(splicingoverlapextentionPCR,SOEPCR)法,将SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽部分通过一富含甘氨酸/丝氨酸的Linker(G4S)3连接,形成SLA-2-Linker-β2m全长,并插入原核表达质粒pMAL-p2X,转化E.coliTB1,IPTG诱导表达。表达得到的融合蛋白分别经过Western-blot、纯化及FactorXa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(circulardichroismspectrum,CD)测定蛋白的二级结构。【结果】SDS-PAGE和Western-blot均证实融合蛋白MBP-SLA-Ⅰ大小为84.1kD。SLA-I单体蛋白大小为41.6kD。圆二色谱分析单体蛋白和融合蛋白二级结构元件α-螺旋、β-折叠、转角和随机卷曲的符合率分别达到了100%、90.6%、88.5%和96.9%。【结论】结果表明重构的SLA-I复合体具有正确的二级结构,可以用于体外多肽结合等研究。
- 高凤山李新生李云岗郝惠芳方勤美夏春
- 关键词：复合体圆二色谱
