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支气管肺发育不良患儿肺表面活性蛋白-B内含子4基因多态性被引量：7: 2012年; 目的了解支气管肺发育不良（bronchopulmonarydysplasia，BPD）患儿肺表面活性蛋白-B（surfactantproteinB，SPB）内含子4基因多态性的改变。方法对2008年7月至2011年7月在华中科技大学同济医学院附属同济医院新生儿重症监护病房收治的45例BPD患儿（BPD组）采用聚合酶链反应技术、琼脂糖凝胶电泳分离以及克隆测序法行SP—B内含子4片段长度多态性检测，并以无肺部疾病的99例患儿为对照（对照组），分析其等位基因[野生等位基因、变异等位基因（插入等位基因和缺失等位基因）]频率和基因型[野生型、变异型（插入型和缺失型）]频率在2组间的差异。研究结果采用两样本均数t检验或X2检验进行统计学分析。结果BPD组与对照组野生等位基因频率分别为83．3％（75／90）和91．9％（18e／198），变异等位基因频率分别为16．7％（15／90，其中插入等位基因8例，缺失等位基因7例）和8．1％（16／198，其中插入等位基因8例，缺失等位基因8例），2组比较差异有统计学意义（x2=4．75，P=0．029）。BPD组基因型频率野生型为71．1％（32例），变异型为28．9％（13例，其中插入型7例，缺失型6例），对照组野生型为85．8％（85例），变异型为14．1％（共14例，插入型6例，缺失型8例），2组比较，差异有统计学意义（x2=4．42，P=0．036）。结论BPD患儿SP—B内含子4基因变异发生率高，提示SP—B内含子4变异可能与BPD遗传易感性相关。; 赵玲霞李文斌蔡保欢袁文浩刘伟徐洪涛潘睿常立文; 关键词：支气管肺发育不良内含子多态现象

高体积分数氧致A549细胞肺表面活性物质蛋白-A表达的变化被引量：4: 2012年; 目的探索高体积分数氧(高氧)致A549细胞肺表面活性物质蛋白(SP)-A表达的变化规律。方法将A549细胞分为高氧组和常氧组。高氧组细胞置于含950 mL·L-1氧气和50 mL·L-1二氧化碳的条件下培养,常氧组以空气替代氧气,于0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h在倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,提取细胞内总蛋白,采用硫代巴比妥酸比色法检测其丙二醛(MDA)水平,Western blot检测其SP-A表达水平。结果高氧48 h可导致A549细胞生长明显减慢,72 h后细胞生长停滞,可见较多漂浮死亡细胞,96 h后漂浮死亡细胞明显增多。高氧组各时间点A549细胞SP-A表达水平均高于常氧组,高氧24 h SP-A表达增多最显著,此后增多的幅度逐渐减小,高氧48 h后细胞内MDA水平显著高于常氧组,随时间延长,MDA水平进一步升高。结论高氧可导致A549细胞损伤,SP-A表达在细胞高氧损伤早期代偿性增加,晚期降低,推测SP-A表达降低可能与细胞损伤加重有关,增加SP-A的表达可能有助于减轻高氧引起的细胞损伤。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：高体积分数氧 A549细胞

真核表达载体pIRES2-EGFP-SP-B-C／T1580的构建及其在293T细胞中的表达被引量：1: 2012年; 目的构建两种人肺表面活性物质蛋白B（surfactant protein B，SP．B）基因变异型的真核表达载体，研究SP-B基因多态性与支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）的关系。方法应用基因重组技术，构建pIRES2-EGFP-SP-B-C1580和plRES2-EGFP-SP-B．T1580真核表达质粒，经测序鉴定后，采用脂质体法转染293T细胞系，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在293T细胞中的表达，逆转录一聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（reverse transcription-polymerase chain reaction-re-striction fragment length polymorphism,RT-PCR-RFLP）检测SP-B-C/T1580mRNA的表达，Westernblot检测SP-B蛋白的表达。结果两个重组质粒含有完整sP-BcDNA，在1580位点碱基序列分别为C和T，转染293T细胞后有相应的mRNA及蛋白表达。结论成功构建了真核表达载体plRES2．EG。FP-SP-B-C／T1580，为揭示支气管肺发育不良的发生机制奠定基础。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：支气管肺发育不良遗传学遗传学

Lipofectamine 2000和jetPRIME^(TM)对A549细胞转染效率及毒性的比较研究: 2012年; 目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例(μg/μl)在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例(μg/μl)为1∶2.5时转染率最高,达(50.6±4.9)%,细胞存活率为(89.2±9.1)%;质粒与jetPRIMETM比例(μg/μl)在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例(μg/μl)为1∶2时转染率最高,为(30.6±2.8)%,细胞存活率为(100.6±4.8)%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异(P<0.01,P<0.05)。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：A549细胞转染细胞毒性

支气管肺发育不良患儿肺表面活性蛋白-B基因9306（A／G）多态性被引量：2: 2013年; 目的了解支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）患儿肺表面活性蛋白-B（surfactant protein-B，SP—B）基因9306（A／G）位点多态性的分布情况。方法研究对象为2008年1月1日至2012年6月30日华中科技大学同济医学院附属同济医院新生儿重症监护病房收治的86例BPD患儿与156例无相关疾病的患儿（对照组），采用限制性片段长度多态性-聚合酶链反应技术检测SP—B基因9306（A／G）位点基因型，样本的群体代表性进行HardyWeinberg平衡检验；2组病例基因型频率比较采用Armitage’s趋势检验。结果BPD组AA基因型频率为67．4％（58／86），AG基因型频率为23．3％（20／86），GG基因型频率为9．3％（8／86），对照组各基因型频率分别为63．5％（99／156）、30．8％（48／156）和5．8％（9／156），2组差异没有统计学意义（X^2=0．003，P=0．957）。BPD组A等位基因频率为79．1％（136／172），G等位基因频率为20．9％（36／172），对照组A、G等位基因频率分别为78．8％（246／312）和21．2％（66／312），2组差异没有统计学意义（X^2=0．003，P=0．954）。结论汉族婴儿SP—B基因9306（A／G）位点的基因多态性与BPD发病无直接相关性。; 蔡保欢李文斌刘伟王席娟赵玲霞莫璐霞常立文; 关键词：支气管肺发育不良基因多态性

地塞米松对氧化应激状态下H441细胞肺表面活性蛋白A、B、C和D的mRNA及蛋白质表达的影响被引量：1: 2013年; 目的探讨地寒米松对氧化应激时H441细胞肺表面活性蛋白（surfactant protein．SP）A、B、C和D表达的影响。方法采用H2O2制作H441细胞氧化晦激模型。实验分为对照组、不同浓度地塞米松（1、10和100μmol／L）组、H2O2（100μmol／L）损伤组、H2O2（100μmol／L）±地塞米松（100μmol／L）组。共培养24h后采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测各组培养细胞中SP-A、B、C和DmRNA的表达水平，采用Western印迹技术榆测SPA、B、C和D蛋白的表达。多组间比较采用单因素方差分忻，并采用Dunnett’s T3检验进行两两比较。结果（1）H2O2损伤组SP-A mRNA表达水平明娃高丁对照组（4．0016±0．3618与0．9914±0．4170），向SP-C与SPD表达明显低于对照组（SP-C：0．2840±0．0586与0．9719±0．1022；SP—D：0．6199±0．0074与0．9518±0．0614），差异均有统计学意义（P均〈0．05）；与H2O2损伤组相比，H2O2±地寒米松组SPAmRNA的表达水平下降（2．5191±0．3463），而SP-D mRNA的表达水平升高（0．9076±0．0167）。差异均有统计学意义（P均〈0．05）。（2）H2O2损伤组SP-A蛋白表达水平明显高于对照组（2．1795±0．0645与0．9728±0．0090），SP-B、SP—C与SPD蛋白表达水平明显低于对照组（SP-B：0．2593±0．0086与0．7253±0．0134；SP-C：0．5592±0．0111与0．9472±0．0052；SP-D：1．1550±0．0237与1．2991±0．0298）；与H2O2损伤组相比，H2O2±地塞米松组SPA蛋白表达降低（1．4974±0．0185），而SP-B、SP-C与SP-D蛋白表达水平升高（0．7389±0．0182、0．9244±0．0282和1．3339±0．0136），筹砰均有统计学意义（P均〈0．05）。结论地塞米松可能通过调节SP的表达，对H441细胞氧化心激损伤发挥保护作用。; 蔡保欢李文斌刘伟王席娟赵玲霞莫璐霞王靓常立文; 关键词：氧化性应激细胞系肺表面活性物质相关蛋白质类地塞米松

血管内皮生长因子基因多态性与支气管肺发育不良相关性研究被引量：13: 2012年; 目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)基因多态性与支气管肺发育不良(BPD)相关性。方法选自2009-07-01—2012-02-01华中科技大学同济医学院附属同济医院收治的符合BPD诊断标准的患儿64例(BPD组)和同期住院的无肺部疾病患儿106例(对照组)。利用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析两组VEGF+405、-2578基因频率分布,酶联免疫吸附试验(ELISA)分析BPD组血浆VEGF浓度。结果 (1)VEGF+405G>C:BPD组中G的基因型频率和等位基因频率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);VEGF-2578C>A:BPD组中A的基因型频率和等位基因频率均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)BPD组VEGF+405GG/GC血浆表达低于VEGF+405CC(P<0.05),VEGF-2578CC/CA血浆表达与VEGF-2578AA差异无统计学意义(P>0.05)。结论 VEGF+405、-2578基因多态性和BPD相关,推测其和BPD遗传易感性相关。VEGF+405多态性与VEGF血浆表达相关,血浆中VEGF减低可能是BPD发病机因素之一。; 袁文浩常立文李文斌刘伟赵玲霞徐洪涛潘睿; 关键词：血管内皮生长因子单核苷酸多态性支气管肺发育不良遗传易感性

SP-B中间产物特异性抗体的制备与鉴定: 2013年; 目的制备和鉴定表面活性物质蛋白B(surfactant protein B,SP-B)加工处理过程中部分中间产物的特异性抗体。方法利用Lasergene 7.0和Macvector 11.0.4软件进行抗原表位分析,确定作为抗原的3条多肽序列,将人工合成的多肽与钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联,免疫兔制备抗血清,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫前血清背景和免疫后血清效价,抗原亲和纯化抗血清,超滤浓缩抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blot)鉴定抗体特异性。结果免疫前兔血清背景均低,免疫后抗血清效价均达到要求,抗原亲和纯化后所得抗体纯度及效价高,特异性好。结论成功制备了3种SP-B中间产物特异性多克隆抗体,为深入研究SP-B的加工处理奠定了基础。; 徐洪涛杨慧常立文李文斌赵玲霞袁文浩刘伟蔡保欢王席娟; 关键词：多克隆抗体

基因多态性与支气管肺发育不良遗传易感性分析: 目的探讨肺表面活性蛋白B(surfactant protein B,SP-B)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因多态性与支气管肺发育不良(bronch...; 袁文浩李文斌刘伟赵玲霞潘睿常立文

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