刘玉忠
- 作品数：6 被引量：21H指数：3
- 供职机构：中国中医科学院中医药信息研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家杰出青年科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 三七及屏边三七病程相关功能基因的克隆
- 本发明涉及三七及屏边三七植物体内的一些病程相关功能基因，该基因系首次利用RT-PCR技术从三七和屏边三七中克隆而得到，详细序列见序列表1。植物在长期进化进程中已发展出一套复杂机制用于抵抗坏境中的有害生物入侵，当病原菌入侵...
- 黄璐琦申业崔秀明李瑞博刘玉忠
- 文献传递
- 利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体被引量：9
- 2014年
- NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应,利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体,以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。根据Gateway技术要求,设计含有attB接头的引物,使用NEB的Phusion超保真聚合酶,通过PCR方法,扩增SmNAC1基因的特异性片段。通过BP重组反应,将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上,再通过LR重组反应,利用入门载体上的SmNACi特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。实验结果表明Gateway载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上,为植物基因转化提供基础。
- 赵容荣齐仙刘玉忠申业黄璐琦
- 关键词：RNAI
- 丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究被引量：3
- 2014年
- WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白，是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的 SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达，SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约36 kDa，与预测的蛋白相对分子质量一样，说明该基因在大肠杆菌中成功表达。对影响蛋白表达的4个因素：诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化，结果表明在大肠杆菌BL21（DE3）中，当A600达到约1.0~1.5时，加入0.2 mol·L-1的IPTG，在20 ℃诱导培养12 h后SmWRKY1蛋白的表达量较高。原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在，采用尿素提取包涵体蛋白，用Ni2＋亲和色谱法纯化表达蛋白，纯化后蛋白的质量浓度为2.454 g·L-1。经蛋白质印迹检测，His-Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白，进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步开展 SmWRKY1 基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础。
- 刘玉忠申业荣齐仙吴文燕李瑞博吴志刚陈敏
- 关键词：丹参包涵体蛋白蛋白质印迹
- 丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析被引量：1
- 2014年
- 根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(Sm KOL)全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(Me JA)诱导丹参毛状根不同时期的Sm KOL表达水平。克隆得到的Sm KOL全长c DNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 k Da,等电点p I 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受Me JA诱导后,表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条Sm KOL全长c DNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。
- 胡雅婷高伟刘雨佳程琪庆苏平刘玉忠陈敏
- 关键词：丹参CDNA末端快速扩增生物信息学分析
- 新疆紫草PAL,HMGR,PGT基因的过表达和RNA干扰载体的构建
- 2014年
- 新疆紫草Arnebia euchroma是药用紫草的主要来源,其最重要成分紫草素类化合物具有很高的药用和工业价值。研究采用GATEWAY技术,构建新疆紫草次生代谢关键酶基因PAL,HMGR,PGT的过表达载体和RNAi载体,为相关转基因株系的构建搭建好平台。新疆紫草次生代谢关键酶基因过表达和RNA干扰载体的构建,是基于遗传物质的遗传研究平台的搭建,对于次生代谢途径上基因功能验证和功能基因的挖掘提供了极大的便利,同时也填补了新疆紫草在转基因领域研究的空白,对于培育紫草素高产株系具有重要意义。
- 谢腾刘玉忠王升刘谈康利平郭兰萍
- 关键词：新疆紫草RNAI载体GATEWAY技术
- 三七病程相关蛋白1基因的克隆与表达分析被引量：8
- 2014年
- 在生物信息学分析基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从三七中获得病程相关蛋白1(pathogensis-related protein 1,PR1)基因的开放阅读框,命名为PnPR1,测序结果显示该序列长501 bp,编码166个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.1 kD。利用NCBI/Blastp和BioEdit软件进行同源性比对显示,PnPR1基因编码蛋白与葡萄、烟草、番茄等高等植物中的PR1蛋白同源性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白的保守结构域。将构建的重组载体pET28a(+)-PnPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同诱导时间、诱导温度、IPTG诱导浓度和IPTG添加时间下对诱导条件进行优化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,PnPR1基因编码蛋白的最佳诱导条件为:IPTG终浓度0.4 mmol·L-1、IPTG添加时间为转接后4 h、诱导温度28℃、诱导时间20 h。这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备奠定了一定的基础。
- 李瑞博崔秀明刘玉忠吴志刚林淑芳申业黄璐琦
- 关键词：病程相关蛋白生物信息学分析原核表达
