何延华
- 作品数：9 被引量：18H指数：3
- 供职机构：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪Toll样受体9基因的克隆、序列分析及其结构预测被引量：2
- 2009年
- 本研究应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中,克隆了猪Toll样受体9基因(pTLR9)。基因序列分析表明,克隆的pTLR9基因ORF为3 093 bp,编码1 030个氨基酸,含18.5%的亮氨酸,含有24个氨基酸的信号肽序列,属于Ⅰ型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域;与GenBank上登载的pTLR9参考序列(AY859728)的同源性为99.3%,与牛、马、羊和人的同源性较高,与家鼠、褐鼠的次之,TLR9的演化关系与亲缘关系密切。
- 段凤云景志忠房永祥陈国华乔军王生富何延华
- 关键词：基因克隆生物信息学
- 牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达
- 2010年
- 用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.
- 王生富孙晓林段风云何延华闫鸿斌景志忠
- 关键词：牦牛巴斯德毕赤酵母分泌表达
- 牛胸腺素原α基因的原核表达与分析鉴定
- 2011年
- 为了把牛胸腺素原α(ProTα)开发为免疫增强剂,从重组克隆载体pMD18-T-ProTα上扩增ProTα基因,分别构建和筛选出了pGEX-4T-1-ProTα、pET-30a(+)-ProTα的BL21、BL21codon plus和Rosetta Blue(DE3)plys重组原核表达菌株,采用不同的条件组合对其进行诱导表达。结果,重组菌BL21codon plus-pET-30a(+)-ProTα表达出约24ku和30ku两个蛋白条带,且在37℃、IPTG浓度为0.5mmol/L、诱导3h时表达量最大,重组蛋白主要以可溶性形式存在;而pGEX-4T-1-ProTα重组菌在诸多条件下都未表达出目的蛋白。纯化产物的Western-blot分析显示,重组蛋白可与兔抗人ProTα多抗发生特异性免疫反应,表明重组蛋白具有免疫学活性结构。研究结果为重组ProTα蛋白的结构与功能研究奠定了基础。
- 李小庆陈国华房永祥何延华冯海燕景志忠
- 关键词：原核表达
- 牦牛IL-4基因的克隆及其遗传演化关系分析被引量：2
- 2008年
- 克隆牦牛白细胞介素-4（IL～4）基因，并对其进行遗传演化分析。从刀豆素（ConA）和脂多糖（LPS）联合刺激培养的牦牛外周血淋巴细胞提取总RNA．利用RT—PCR方法扩增牦牛IL-4全长cDNA，将其克隆到pMD18～T载体上，测序后进行序列分析。成功克隆到牦牛IL-4基因全序列，序列分析表明，克隆的牦牛IL-4基因序列与GenBank所登录的牛IL-4核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别这99．8％和100％，与人、猕猴、猪、山羊、马等物种的核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别在44．4％～96．3％和27．4％～91．1％之间。在国内首次成功地从牦牛外周血淋巴细胞中克隆到IL-4的基因，其ORF为408bp，推导编码135个氨基酸。
- 何延华房永祥陈国华段风云王生富李小庆景志忠
- 关键词：白介素4克隆牦牛
- 牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析被引量：4
- 2009年
- 为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析。从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200bp～1000bp之间。随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率。结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量。本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因。
- 何延华景志忠陈国华房永祥蒙学莲李小庆段风云王生富
- 关键词：抑制消减杂交CDNA文库
- 猪CD8β基因的克隆、表达及其结构与功能分析被引量：6
- 2008年
- 本研究应用RT-PCR技术,从猪胸腺细胞总RNA中扩增、克隆了猪CD8β基因,序列分析表明CD8β含621bp的开放阅读框,编码207个氨基酸,与NCBI/GeneBank已发表的参考基因的核苷酸及推导氨基酸序列的同源性分别为97.8%和96.8%,与人、小鼠和鸡CD8β蛋白的氨基酸同源性分别为75.7%、67.9%和33.3%。根据大肠杆菌密码子偏嗜性改造目的基因,构建了pET28a/PCD8β原核表达系统,并经诱导获得高效表达的分子量为24ku的重组蛋白(rPCD8β),表达量占菌体蛋白总量的30%。利用生物信息学和分子生物学软件对猪CD8β基因编码的蛋白进行结构预测,表明猪CD8β成熟蛋白为跨膜蛋白,其中172aa在胞外区,22aa在跨膜区,10aa在胞内区;蛋白骨架内含有较多的柔性区域,而且分布不均匀,能形成结构松散的球状蛋白;猪CD8β分子V区三维结构与鼠的具有非常相似的空间结构,与人的差别较大,这为猪CD8β蛋白结构与功能的进一步研究奠定了基础。
- 王生富景志忠陈国华房永祥莫斯科段凤云何延华
- 关键词：Β基因克隆
- 牦牛外周血单个核细胞（PBMC）抑制性消减cDNA文库的构建以及重要功能分子的克隆分析
- 外周血免疫相关细胞及其分泌的功能分子,在免疫调节、抗微生物、抗肿瘤以及细胞信号传导等方面发挥重要作用。脂多糖/(LPS/)和刀豆素A/(ConA/)作为丝裂原能激活淋巴细胞和单核细胞分泌一些细胞因子,这些因子的分泌受一个...
- 何延华
- 关键词：外周血单个核细胞抑制消减杂交CDNA文库
- 文献传递
- 猪Toll样受体7基因的克隆及序列分析被引量：5
- 2010年
- 目的:研究猪TLR7基因的分子结构与功能。方法:用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增技术,从猪脾脏淋巴细胞中克隆猪Toll样受体7基因(pTLR7),利用生物信息学技术预测其结构与功能。结果:基因序列分析表明,克隆的pTLR7基因为3153bp,编码1050个氨基酸,富含16.2%的亮氨酸;同源性分析显示,与GenBank上登载的猪TLR7参考序列(DQ333222)的同源性为98.8%,与牛和绵羊的同源性较高,与马、狗、人、家鼠、褐鼠的次之,其遗传演化关系与亲缘关系密切;推导氨基酸的分子结构预测表明,该分子属于I型跨膜受体,由胞外区(588个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(174个氨基酸)组成,有信号肽序列、富含亮氨酸的重复序列(LRR)和Toll/IL-1R同源区结构域。结论:成功克隆了猪TLR7基因,预测分析证实具有典型的TLR家族结构特征,这为进一步研究其参与病原分子模式识别和信号传导奠定了基础。
- 段凤云房永祥陈国华王生富何延华景志忠
- 关键词：分子克隆
- 牛趋化因子受体4基因的克隆表达及序列分析被引量：2
- 2009年
- 采用RT-PCR技术,从被刺激诱导的牛外周血单个核细胞（PBMC）中克隆了牛趋化因子受体4（CXCR4）全长基因,并将CXCR4基因和CXCR4基因N端1~126 bp（CXCR442 aa）片段分别亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,命名为pGEX-4T-1-CXCR4、pGEX-4T-1-CXCR442 aa。获得重组菌株后,采用不同的IPTG浓度、不同诱导时间、不同温度和不同培养基等组合诱导表达这两种重组菌,其中pGEX-4T-1-CX-CR442 aa重组菌获得了表达,并在37℃、IPTG浓度为0.8 mmol/L、诱导6 h时表达量最大,约占菌体总蛋白的45%,目的蛋白主要以包涵体的形式存在;而pGEX-4T-1-CXCR4重组菌未表达出目的蛋白。
- 李小庆何延华陈国华房永祥冯海燕赵娜景志忠
- 关键词：CXCR4基因克隆
