傅俊华
- 作品数：4 被引量：15H指数：2
- 供职机构：东北农业大学生命科学学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金哈尔滨市科技创新人才研究专项资金黑龙江省青年科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 融合蛋白GST-Ulp1p在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其活性鉴定被引量：7
- 2010年
- 利用基因工程技术,体外重组小分子类泛素修饰蛋白酶1(Ulp1)的活性片段,获得高表达、高特异性重组蛋白酶。从酿酒酵母Saccharomyces cerevisia中提取Ulp1编码第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段(Ulp1p),在其C端加入6×His并连接到大肠杆菌表达载体pGEX中,构建重组表达质粒pGEX-Ulp1p-his6。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,氨苄青霉素抗性筛选转化子。表达、纯化后,以SUMO融合蛋白检测其活性。经过优化,该蛋白可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40.12%。可通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱或Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到纯度98%的蛋白。经酶切分析,比活力为1.375×104U/mg。融合蛋白GST-Ulp1p-His6无需切除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,具有很高的活性,制备简易;6×His标签,有利于底物蛋白切割后纯化,减少蛋白损失。本研究为制备高活力的SUMO蛋白酶提供了一个新方法。
- 傅俊华王琪尹杰超刘铭瑶李宁姚文斌任桂萍李璐李德山
- 关键词：活性鉴定
- 利用SUMO系统高效可溶性表达重组人TNF-α被引量：2
- 2010年
- 目的:从人淋巴细胞中克隆人肿瘤坏死因子-α(hT-NF-α)基因,构建原核表达载体,通过表达、纯化,获得具有生物学活性的hTNF-α,为深入研究和利用hTNF-α奠定基础。方法:利用RT-PCR方法从人淋巴细胞中克隆hTNF-α基因,并分别插入到pGEX-6P-1的GST标签和pHisSUMOexpression的SUMO(small ubiquitin-like modifier)标签下游构建成重组表达载体pGEX-6P-1-hTNF-α和pHisSUMO-hTNF-α。将两种载体分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3),比较两种载体hTNF-α表达量及可溶性的差异。选择表达效果较好的重组载体对hTNF-α进行诱导表达,经纯化并切去融合标签后获得成熟hTNF-α蛋白。以L929细胞为靶细胞,利用MTT比色法检测其细胞毒活性。结果:克隆得到hTNF-α编码基因,利用pGEX-6P-1载体表达的GST-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的27%,主要以包涵体形式表达,经低温诱导后可溶性提高了约50%,但表达量有所降低。而利用pHisSUMO-expression表达的SUMO-hTNF-α融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的30%以上,且主要以可溶形式存在。本实验中选择SUMO系统表达hTNF-α,纯化后成熟蛋白纯化产物纯度达98%以上。活性测定结果表明,获得的成熟hTNF-α对L929的细胞毒活性为5.01×108U/mg。结论:与GST标签相比,SUMO利于hTNF-α的可溶性表达。经过纯化并切去融合标签后获得了纯度较高的具有生物学活性的hTNF-α蛋白。
- 刘生伟任桂萍傅俊华刘铭瑶李宁郝建权李德山
- 关键词：TNF-ΑSUMOGST包涵体融合蛋白
- 利用SUMO表达系统高效可溶性表达鸡传染性法氏囊病病毒VP3基因被引量：5
- 2011年
- 为评价SUMO原核表达系统(pHisSUMO Express)对病毒基因的可溶性表达,本研究从人工接种发病的鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料组织样品中提取总RNA,通过RT-PCR扩增IBD病毒(IBDV)VP3基因,并将其克隆于pHisSUMO中构建了重组表达质粒pHisSUMO-VP3,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)PlysS,经IPTG诱导,得到可溶性表达的融合蛋白SUMO-VP3。结果表明,该融合蛋白表达量占细菌总蛋白35%,经HisTrapTMFF crude column层析柱纯化后的SUMO-VP3蛋白可被SUMO蛋白酶Ⅰ有效切割,获得无标签的VP3蛋白,经western blot鉴定表明该VP3蛋白具有良好的抗原性。本研究表明pHisSUMO Express表达系统是高效可溶表达外源蛋白的有效工具,所表达的病毒蛋白具有良好的抗原性,为病原诊断抗原的研究和制备提供有效表达系统。
- 曲栗尹杰超李宁刘生伟傅俊华姚文兵谷学佳郝建权任桂萍李德山
- 关键词：SUMO鸡传染性法氏囊病病毒VP3基因
- SUMO表达系统高效、可溶性表达重组鼠源IL-1β被引量：1
- 2010年
- 目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础。方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO ex-press中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白。用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37kD,切割后的成熟蛋白为17kD,与理论值相符。且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在。Western blot证实该蛋白为mIL-1β。成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性。结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白。
- 郝建权任桂萍刘生伟傅俊华谷学佳姚文兵李宁李德山
- 关键词：SUMO融合蛋白原核表达MTT活性检测
