刘启才
- 作品数：124 被引量：274H指数：9
- 供职机构：广州医科大学实验医学研究中心更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学环境科学与工程更多>>
- 人肝细胞生长因子受体启动子荧光素酶表达载体的构建及活性测定
- 2013年
- 目的构建含人肝细胞生长因子受体(C-MET)启动子-223^+60区域的荧光素酶报告基因质粒,并测定其在卵巢癌细胞株中的活性。方法应用PCR法扩增获得含有人C-MET基因启动子-223^+60区域的DNA片段,将其连接至荧光素酶质粒pGL3-Basic中,得到pGL3-C-MET-Promoter重组质粒;经限制性内切酶酶切及测序得以鉴定;将该质粒转染4株卵巢癌细胞,检测细胞中荧光素酶的活性。结果双酶切及测序结果证实pGL3-C-MET-Promoter重组质粒插入片段序列正确,克隆的C-MET基因片段具有启动子活性,在卵巢癌细胞株OVCAR3细胞中的活性最高。结论成功构建了pGL3-C-MET-Promoter报告基因重组质粒,为进一步研究C-MET对卵巢癌生物学行为的影响奠定了基础。
- 李祯生秀杰孙曼汪志辉刘启才
- 关键词：肝细胞生长因子受体卵巢癌启动子
- Survivin和RhoA双基因沉默对卵巢癌细胞的增殖与侵袭影响被引量：1
- 2013年
- 目的:探讨RNA干扰(RNAi)双向沉默Survivin和RhoA基因表达对人卵巢癌HO8910PM细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法:构建Survivin和RhoA基因的串联microRNA干扰载体(Survivin-RhoA-microRNA),通过脂质体介导转染人卵巢癌HO8910PM细胞作为实验组,对照组为空载体转染组。转染48小时后,RT-PCR检测Survivin和RhoA的mRNA表达,Western-Blot检测Survivin和RhoA的蛋白质表达;利用MTT法、Transwell小室体外侵袭实验及流式细胞术检测转染后卵巢癌细胞的增殖、侵袭及凋亡情况。结果:Survivin-RhoA-microRNA明显抑制了HO8910PM细胞中Survivin和RhoA基因mRNA和蛋白的表达:转染48小时后,实验组Survivin mRNA和RhoA mRNA表达抑制率分别为68.82%、90.23%,Survivin和RhoA蛋白表达抑制率分别为63.91%、88.47%;MTT分析显示实验组细胞OD490的值为0.706±0.177,较对照组(1.172±0.241)明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测实验组细胞凋亡率为36.41±3.34%,较对照组(2.92±0.78%)明显升高(P<0.01);实验组细胞侵袭百分比为12.56±6.17%,较对照组(32.96±5.14%)明显降低(P<0.05)。结论:成功构建Survivin和RhoA串联microRNA干扰载体(Survivin-RhoA-microRNA)。Survivin和RhoA双基因沉默显著抑制了卵巢癌HO8910PM细胞的增殖和侵袭能力,并增加其凋亡率,两者具有协同作用,为双靶点治疗卵巢癌提供了新的思路和策略。
- 刘筱群刘启才康佳丽李晓艳付欣
- 关键词：靶向沉默卵巢癌SURVIVINRHOA细胞侵袭
- 真核生物蛋白合成启始因子在喉及喉咽癌手术切缘中的表达被引量：3
- 2005年
- 目的探讨真核生物蛋白合成启始因子4E(eukaryoticinitiationfactor4E,eIF4E)在18例喉癌和7例喉咽癌手术切缘中的表达及意义。方法25例病例中,喉癌18例,喉咽癌7例,采用Westernblot分析eIF4E在喉癌和喉咽癌手术切缘中的表达,并与自身正常黏膜和肿瘤核心组织的表达相比较。结果eIF4E在癌肿核心组织的表达为75.81±20.77,手术切缘为12.90±5.88,正常黏膜为12.20±5.56,其中7例手术切缘eIF4E表达高于正常黏膜2倍以上,为26.42±1.81。本组病例随访3年以上,共6例局部复发,其中4例切缘eIF4E过度表达。结论eIF4E过度表达与喉癌和喉咽癌组织恶变有关,eIF4E的表达可被考虑作为判断喉癌和喉咽癌切缘安全性的指标。
- 雷文斌苏振忠文卫平柴丽萍蒋爱云刘启才
- 关键词：喉咽癌EIF4E手术切缘蛋白合成心组织
- 腺病毒E1A蛋白对大鼠肺泡上皮细胞谷胱甘肽活性的影响及其机制探讨被引量：1
- 2008年
- 目的研究腺病毒E1A蛋白潜伏感染对大鼠肺泡上皮细胞谷胱甘肽（GSH）活性的影响及其机制。方法构建稳定表达腺病毒E1A蛋白的大鼠肺泡上皮细胞，观察氧化剂刺激时细胞内GSH含量变化，检测GSH合成限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）催化活性的变化，通过观察γ-GCS催化亚单位（GCLC）基因蛋白表达水平、mRNA表达水平和5’-上游调控序列调控的荧光素酶活性的改变，了解影响酶活性改变的机制。结果腺病毒E1A蛋白表达抑制氧化应激时GSH的合成，抑制γ-GCS催化活性和蛋白表达水平，抑制GCLC基因mRNA表达，与5’-上游调控序列报导系统获得的结果一致。结论腺病毒潜伏感染可能通过抑制GCLC基因5’-上游调控序列的促转录活性，抑制了γ-GCS的表达和催化活性，从而抑制了氧化应激时GSH的合成，削弱机体的抗氧化作用，加重氧化损伤，可能是腺病毒潜伏感染参与慢性阻塞性肺病（COPD）发病的机制之一。
- 方怡李冰陈娟刘启才冉丕鑫
- 关键词：谷胱甘肽
- BRMS1 shRNA表达载体的构建及对卵巢癌细胞转移的影响被引量：2
- 2011年
- 目的探讨乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1)表达抑制对人卵巢癌细胞转移能力的影响及机制。方法构建靶向BRMS1基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-BRMS1,并转染人卵巢癌OVCAR3细胞,经G418筛选获得稳定转染株。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测BRMS1 mRNA和蛋白的表达,采用黏附实验检测细胞的黏附能力,采用Tr-answell小室法检测细胞的体外侵袭和迁移能力,采用实时荧光定量PCR法检测基因沉默后miR-146a的表达。结果经酶切和DNA测序证明重组载体构建成功。稳定转染BRMS1 shRNA后,OVCAR3细胞中BRMS1 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制。BRMS1表达下调后,细胞的黏附、侵袭和迁移能力较对照组明显增强。干扰组细胞的miR-146a mRNA表达下调了(44.69±4.60)%。结论干扰BRMS1基因的表达可促进卵巢癌细胞的黏附、侵袭和迁移,其机制可能与下调miR-146a的表达有关。
- 周映群生秀杰宋清源刘启才
- 关键词：RNA干扰乳腺癌转移抑制基因1MIR-146A
- Epstein-Barr病毒A73基因在鼻咽癌组织中的表达及其细胞内定位研究被引量：5
- 2003年
- 背景与目的:A73基因是EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)BamHⅠA区右向转录物家族(BamHⅠArightwardtranscripts,BARTs)的主要成员,该家族基因转录表达于多种EB病毒相关细胞和肿瘤。本研究旨在了解A73基因在广东地区鼻咽癌病例中的表达特点,克隆该基因并明确其在上皮细胞中表达的亚细胞区域。方法:收集鼻咽癌组织、鼻咽非癌组织和鼻咽癌外周血淋巴细胞,常规培养SUNE1、B95.8、Raji和BJAB等细胞株,分别提取各样品的DNA和总RNA,以巢式PCR扩增W序列来检测EB病毒的感染,RT-PCR检测A73基因在各组织、细胞株中的表达,克隆测序后定向亚克隆入pEGFP-C2绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)表达载体,通过脂质体转染技术将其转入人胚肾上皮(humanembryokidney293,HEK293)细胞,RT-PCR检测A73mRNA的表达,并通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白表达的亚细胞区域。结果:除BJAB细胞株外,所有标本中均检测到EB病毒W序列;A73mRNA在鼻咽癌组织中的表达率为79.63%(43/54),在鼻咽非癌组织中则仅为4%(1/25),两者差异有显著性(P<0.001);鼻咽癌外周血淋巴细胞中未检测到A73表达,SUNE1细胞中A73的表达高于B95.8和Raji细胞。所构建的A73重组质粒可稳定表达于HEK293细胞,其编码蛋白的表达以胞浆为主。
- 李昂张晓实王鸿鹤姜桔红刘晓琼刘启才曾益新
- 关键词：EPSTEIN-BARR病毒鼻咽癌上皮细胞绿色荧光蛋白
- 葡萄球菌肠毒素A与黑色素瘤抗原A3共表达真核质粒致敏小鼠淋巴细胞对喉癌细胞模型的影响被引量：1
- 2015年
- 目的观察真核质粒p MAGEA3-IRES-SEA免疫小鼠后,鼠脾淋巴细胞对喉癌细胞模型B16/MAGEA3的杀伤作用。方法将葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal endotoxin A,SEA)和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3(melanoma-associated antigen A3,MAGE-A3),构建成基因共表达的真核质粒p MAGEA3-IRES-SEA,用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌。末次免疫2周后,取脾分离淋巴细胞,与B16/MAGE-A3细胞共同培养,MTT法观察活化的淋巴细胞对B16/MAGE-A3的杀伤作用。结果 ptk-IRES-SEA、p IRES2-EGFP/MAGE-A3和p MAGEA3-IRES-SEA质粒组对B16/MAGE-A3细胞特异性杀伤率均高于空白质粒及生理盐水组(P<0.05);p MAGEA3-IRESSEA质粒组杀伤作用大于ptk-IRES-SEA、p IRES2-EGFP/MAGE-A3质粒组(P<0.05)。结论构建的p MAGEA3-IRES-SEA真核质粒可通过电转染的方式输入到小鼠体内,诱导特异性细胞免疫,可提高杀伤B16/MAGE-A3细胞的作用。为DNA疫苗接种途径、方法及抗喉癌疫苗的研究提供了实验依据。
- 李宁吉晓滨谢景华刘启才
- 关键词：喉癌葡萄球菌肠毒素A黑色素瘤抗原体内免疫
- mtHSP70/HSV-TK双基因真核共表达质粒的构建
- 2011年
- 目的构建结核杆菌热休克蛋白70(mycobacterium tuberculosis heat-shock proteins 70,mtHSP70)和自杀基因单纯疱疹病毒-胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidinekinase,HSV-TK)双基因真核共表达质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK。方法登录Genbank查询HSV-TK和mtHSP70基因mRNA序列,应用引物设计软件DNA club分别设计扩增HSV-TK和mtHSP70基因全长cDNA的特异引物。以pcDNA3-TK质粒或mtHSP70质粒DNA为模板,分别采用各自的引物,用prime STAR HS DNA Polymerase进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),获得HSV-TK和mtHSP70基因cDNA片断,连接到T载体pMD18-T上,转化大肠杆菌TG1后用HSV-TK和mtHSP70基因的特异引物进行菌落PCR,确定含有阳性mtHSP70或HSV-TK重组质粒并将阳性pMD18T-TK重组质粒和pMD18T-mtHSP70重组质粒进行上、下游测序,测序结果与基因序列进行同源比较。选定正确的质粒用于HSV-TK和mtHSP70基因的亚克隆,构建质粒PCMV-mtHSP70-IRES-TK,所得阳性克隆摇菌后少量提取质粒,分别用NotⅠ单酶切及EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切进行酶切鉴定。结果构建的pCMV-mtHSP70-IRES-TK质粒分别用NotⅠ单酶切及EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切进行酶切鉴定,酶切产物电泳见特异酶切图谱,确定为重组质粒pCMV-mtHSP70-IRES-TK。结论本实验为后续研究mtHSP70/HSV-TK双基因的协同抗肿瘤作用奠定了实验基础。
- 曾曙光刘启才王素文徐平平章锦才张积仁
- 关键词：真核表达免疫治疗肿瘤
- AngⅡ抑制HUVECs内皮型一氧化氮合酶的表达和NO的释放被引量：1
- 2006年
- 目的：观察AngⅡ对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及内皮NO生成的影响，探讨其可能机制。方法：采用胰蛋白酶消化法进行HUVECs的原代培养，3～5代用于实验；通过RT—PCR和Western Blot检测eNOS的mRNA和蛋白表达水平；利用Gfiees反应原理测定上清NO释放量。结果：与无刺激组相比，AngⅡ（10^-8、10^-7、10^-6）抑制HUVECs eNOS mRNA和蛋白表达（P＜0.05）；HUVECs未受刺激时NO生成量是（50．21±4.39）μM，不同浓度的AngⅡ（10^-8、10^-7、10^-6）与HUVECs共孵育12h可明显减少NO释放（30．01±4．10）μM、（21．33±4．81）μM、（16.35±2．56）μM，使其浓度分别下降49．7％、63.4％、71．1％。结论：AngⅡ明显抑制HUVECs表达eNOS，并呈浓度效应减少内皮NO的释放。
- 徐颖华丁月霞刘世明刘启才
- 关键词：内皮型一氧化氮合酶氧化氮
- 腺病毒介导NK4基因和单核细胞趋化蛋白1基因共表达对胰腺癌细胞的影响被引量：1
- 2013年
- 目的探讨腺病毒介导NK4基因联合单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)基因在胰腺癌中的共表达及对胰腺癌细胞的影响。方法利用重组腺病毒AD-MCP-1、AD-NK4分别单独和联合感染胰腺癌细胞株SW1990,荧光定量RT-PCR和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)法检测NK4和MCP-1的表达情况并观察其对胰腺癌细胞和血管内皮细胞生长的影响。结果当感染复数(MOI)为60efu/细胞时,SW1990细胞的感染效率接近100%,相应基因mRNA表达在AD-MCP-1组、AD-NK4组和联合组中感染后第5天达到最高,但是联合组中的MCP-1和NK4的表达水平要低于单一感染(P<0.05)。相对于其他各组,联合感染后胰腺癌细胞的相对生长率没有明显的改变。AD-NK4组和联合组的上清均有抑制血管内皮细胞生长的作用,但两组比较差异无统计学意义。结论腺病毒介导NK4联合MCP-1基因感染胰腺癌SW1990细胞没有抑制作用,但NK4能够抑制血管内皮细胞的生长从而发挥抑癌作用。
- 周华平彭和平刘启才
- 关键词：胰腺癌单核细胞趋化蛋白1基因治疗腺病毒载体
