倪敏君
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 酿酒酵母甲酸脱氢酶在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其酶学性质
- 2011年
- 目的克隆酿酒酵母甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH)基因,在大肠杆菌中表达、纯化重组蛋白,并进行酶学性质分析。方法以酿酒酵母基因组DNA为模板,采用温度梯度PCR法扩增fdh基因,重叠PCR技术校正fdh中的移码突变,构建重组表达质粒pET-28a-fdh,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,分别采用37℃IPTG诱导、15℃IPTG诱导和37℃乳糖自诱导表达,镍金属螯合亲和层析纯化重组FDH蛋白,并分析重组FDH的酶学性质。结果成功克隆了1 100 bp的fdh基因,碱基突变纠正了基因缺失和置换引起的编码错误;表达的重组FDH相对分子质量约为43 000,37℃乳糖诱导表达的重组FDH主要以可溶形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白比活为7.69 U/mg;重组FDH的最适反应温度和pH分别为30℃和7.5,热稳定性较好,米氏常数分别为:KmNAD+=49μmol/L,Km甲酸=4.5 mmol/L。结论已在大肠杆菌中表达并纯化了重组FDH蛋白,为进一步研究酿酒酵母FDH,利用其构建NAD(P)H辅酶再生体系奠定了基础。
- 倪敏君范立强王怡张锐赵健李素霞
- 关键词：酿酒酵母NADH
- 酿酒酵母甲酸脱氢酶及其辅酶专一性突变体在大肠杆菌中的高表达，纯化及性质研究
- 以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,温度梯度PCR法扩增、重叠PCR技术校正其中的移码突变获得甲酸脱氢酶(FDH)基因fdh;构建重组表达质粒pET28a-fdh,转化大肠杆...
- 倪敏君
- 关键词：酿酒酵母甲酸脱氢酶
- 文献传递
