关锐梨
- 作品数：5 被引量：10H指数：2
- 供职机构：广州医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金博士科研启动基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白枯草芽孢的免疫原性被引量：1
- 2014年
- 目的 构建表面表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（NAP）的重组枯草芽孢,并鉴定其免疫原性.方法 以构建的pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,采用特异性引物扩增幽门螺杆菌NAP基因,与构建的以枯草芽孢外衣蛋白Cotc融合表达的质粒Pus186-Cotc连接,转化枯草杆菌WB600,提取质粒进行酶切、测序鉴定.应用营养耗竭法诱导枯草芽孢生成,提取重组芽孢外衣蛋白进行电泳及免疫印迹分析,并使用NAP特异性抗体免疫荧光检测芽孢表面重组蛋白的表达.以普通芽孢作为对照组,使用表面表达NAP的重组枯草芽孢口服免疫小鼠,ELISA法检测小鼠免疫后0、15、30、45 d的NAP特异性血清IgG水平,判断重组芽孢免疫原性.结果 以pGEX-4T-1-NAP质粒为模板,扩增了NAP基因,并成功克隆入Pus 186-Cotc质粒,重组Pus 186-Cotc-NAP双酶切鉴定可见435 bp目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中.营养耗竭法可诱导重组枯草芽孢生成,产量达1×10^11/L,提取芽孢外衣蛋白电泳见相对分子质量25 600的目的条带.免疫印迹显示使用NAP特异性抗体在相应相对分子质量25 600可见识别带.并且使用NAP特异性抗体可检测到重组芽孢免疫荧光,表明NAP在芽孢表面成功表达.与对照组相比,NAP重组芽孢口服免疫小鼠15d后,NAP特异性IgG升高即达高峰,30、45 d后一直维持在高峰平台期（均P＜0.05）,表明重组芽孢具免疫原性.结论 成功构建了表面表达NAP的枯草芽孢工程菌,重组芽孢口服免疫小鼠具免疫原性,为幽门螺杆菌枯草芽孢疫苗的研制提供了依据.
- 周珍文姚淑雯关锐梨周帅谢永强陈吟霜钟华敏黄莲芬杨镒宇龚四堂
- 关键词：中性粒细胞激活蛋白免疫测定
- 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌CHIPS基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：3
- 2013年
- 目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)趋化抑制蛋白(CHIPS)进行扩增、克隆、序列分析、原核表达及纯化,为后续的疫苗研究奠定基础。方法根据GenBank中趋化抑制蛋白(CHIPS)的序列,设计一对特异性引物,以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增CHIPS基因,纯化DNA进行EcoRI、XhoI双酶切鉴定及测序鉴定,并将CHIPS亚克隆入表达载体PET-28α,转化感受态大肠杆菌BL21,对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导表达重组蛋白,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证重组蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌临床儿童分离株基因组为模板,成功扩增CHIPS基因,基因大小为450bp;重组PET-28a(+)-CHIPS双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示CHIPS在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.98%。经IPTG诱导后,pET-28a(+)-CHIPS/BL21在相应分子量(17kDa)可见融合蛋白在上清表达,免疫印迹检测到目的蛋白。结论成功从儿童分离株MRSA中构建了CHIPS的原核表达系统,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为后续的疫苗研究奠定基础。
- 容莉莉杨镒宇关锐梨关小珊邓秋连谢永强周珍文
- 关键词：MRSACHIPS克隆原核表达
- 金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达被引量：4
- 2012年
- 目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。
- 周帅杨镒宇张妙莲关锐梨邓秋连谢永强容莉莉邓力周珍文
- 关键词：金黄色葡萄球菌肠毒素A克隆
- 嗜麦芽窄食单胞菌Smqnr耐药基因的序列分析及原核表达被引量：1
- 2012年
- 目的:对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch770(SMgzch770)携带的喹诺酮耐药基因Smqnr进行扩增、测序及原核表达,为研究Smqnr蛋白的功能奠定基础。方法:提取SMgzch770基因组染色体,PCR扩增Smqnr全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将Smqnr基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果:以染色体DNA为模板,成功扩增660bpSmqnr基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%以上;SMgzch770Smqnr序列已登录GenBank(登录号:HQ315851);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白约为50kDa,其中Smqnr蛋白约为24kDa。结论:从SMgzch770中成功克隆及表达了Smqnr基因,为进一步进行Smqnr蛋白高级结构测定的结晶试验提供了必须材料。
- 关小珊周珍文关锐梨邓秋连谢永强钟华敏
- 关键词：嗜麦芽窄食单胞菌克隆原核表达
- 幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列被引量：1
- 2011年
- 目的:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白(NAP)基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础。方法:根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析。结果:以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2%,IPTG诱导后,pGEX-4T-1-NAP/BL21在相应分子量(42.8 kD)可见融合蛋白的表达。幽门螺杆菌儿童分离株GZCHl NAP序列已登录GenBank(登录号:GU301881)。结论:从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础。
- 周珍文关锐梨夏慧敏付捷邓秋连谢永强黄勇廖灿龚四堂
- 关键词：幽门螺杆菌儿童中性粒细胞激活蛋白克隆
