方强
- 作品数：16 被引量：41H指数：4
- 供职机构：扬州大学兽医学院江苏省人兽共患病学重点实验室更多>>
- 发文基金：江苏省自然科学基金国家自然科学基金江苏省“青蓝工程”基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 展呈H5N1亚型禽流感病毒M2e表位鞭毛蛋白的构建及其免疫原性
- 以重组质粒pET-fliC和pUC57-M2e2为模板,通过重叠PCR将M2e2基因插入fliC的高变区域,构建嵌合鞭毛基因片段fliC/M2e2。将fliC/M2e2片段插入原核表达载体pET30a+,获得重组质粒pE...
- 游猛潘志明方强耿士忠康喜龙杨芸焦新安
- 关键词：鞭毛蛋白禽流感病毒免疫原性
- 文献传递
- 我国地方品种鸡IL-17 cDNA的克隆、表达及鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:克隆我国地方品种鸡IL-17 cDNA,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性。方法:利用特异性引物,通过RT-PCR方法扩增得到隐性白羽鸡IL-17(ChIL-17)的基因片段,PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-ChIL17。将重组质粒pGEX-6P-1-ChIL17转化E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果:成功扩增出ChIL-17基因片段,大小约510 bp,序列与GenBank登录的序列(NM 204460)相比,核苷酸同源性为99.8%,第477位碱基由G变为A,氨基酸同源性为100%。酶切鉴定结果表明,ChIL-17基因正确克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中。重组质粒pGEX-6P-1-ChIL17在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出Mr约46 000大小的目的蛋白表达条带;Western blot结果表明,表达产物与小鼠IL-17抗体具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达出我国地方品种鸡ChIL-17基因,为抗ChIL-17单克隆抗体的研制奠定了基础。
- 赵雯潘志明耿士忠方强丛秋霞焦新安
- 关键词：IL-17克隆原核表达
- 鸡细胞因子实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用被引量：6
- 2010年
- 根据鸡IL-6I、L-1β、IFN-γ、TGF-β4 mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经鞭毛蛋白刺激的鸡巨噬细胞HD11总RNA,并反转录成cDNA,建立了实时荧光定量PCR方法。结果显示,融解曲线均呈单一峰;同一份cDNA经过3个相同反应体系的实时荧光定量PCR扩增后,其扩增曲线基本重合。HD11细胞经鞭毛蛋白刺激后,前炎性细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达量分别为14.90和29.09,与对照组相比显著升高(P<0.05);而IFN-γ与抗炎性细胞因子TGF-β4的相对表达量无显著变化(P>0.05)。应用该方法检测了3份沙门菌感染鸡血液样品异嗜白细胞中这4种细胞因子的表达水平,前炎性细胞因子IL-6、IL-1β的相对表达量分别为6.19和2.39,与对照组相比显著升高(P<0.05);TGF-β4的相对表达量无明显变化(P>0.05)。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为定量检测鸡细胞因子的一种快速、准确的方法。
- 丛秋霞耿士忠方强潘志明焦新安
- 关键词：实时荧光定量聚合酶链反应细胞因子
- 麻鸭白细胞介素17的原核表达及鉴定被引量：1
- 2011年
- 为表达麻鸭白介素17(duIL-17),本研究提取ConA刺激的麻鸭脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增duIL-17基因片段,将该片段插入克隆载体pCR2.1中构建重组质粒pCR2.1-duIL17。将duIL-17基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组质粒pGEX-duIL17,将其转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。测序结果显示,duIL-17与参考序列(EU366165.1)相比较第174位碱基由C突变为T,并且为沉默突变。SDS-PAGE和westernblot分析显示,诱导表达的重组蛋白GST-duIL17主要以包涵体形式存在,分子量大小约为45ku,duIL-17与抗鸡IL-17抗体具有良好反应性。本研究为制备duIL-17单克隆抗体提供了实验依据。
- 赵雯潘志明耿士忠康喜龙方强丛秋霞焦新安
- 关键词：麻鸭IL-17原核表达免疫反应性
- 展呈H5N1亚型禽流感病毒M2e表位鞭毛蛋白的构建及其免疫原性
- 以重组质粒pET-fliC和PUC57-M2e2为模板，通过重叠PCR将M2e2基因插入fliC的高变区域，构建嵌合鞭毛基因片段fliC/M2e2。将fliC/M2e2片段插入原核表达载体pET30a+，获得重组质粒pE...
- 潘志明游猛方强康喜龙杨芸焦新安
- 关键词：禽流感病毒鞭毛蛋白免疫应答
- 鼠伤寒沙门氏菌Χ4550 FlhD基因缺失株的构建被引量：7
- 2010年
- 为构建鼠伤寒沙门氏菌Χ4550FlhD基因缺失所致的鞭毛缺失株,采用PCR技术从减毒鼠伤寒沙门氏菌Χ4550基因组DNA中扩增出了鞭毛控制操纵子基因(FlhD)两侧翼基因片段,作为FlhD基因敲除所需的上臂和下臂的同源序列;以pKD4质粒为模板,扩增了卡那霉素(Km)抗性基因,并分别克隆入pMD18-T载体中,获得了重组质粒pMD-FlhD-U、pMD-FlhD-D和pMD-Km。将获得的上臂和下臂基因以及卡那霉素抗性基因通过拼接,构建重组质粒pMD-ΔFlhD/Km。将重组片段ΔFlhD/Km亚克隆入pG-MB151自杀质粒,并转化大肠杆菌χ7213,获得重组菌χ7213(pGMB151-ΔFlhD/Km)。将此细菌作为供体菌,与受体菌鼠伤寒沙门氏菌Χ4550进行固相杂交,经同源重组和抗生素筛选,获得鼠伤寒沙门氏菌Χ4550(ΔFlhD/Km)鞭毛缺失株。通过PCR扩增、动力学鉴定及电镜观察,显示鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因已被成功敲除。证实,运用同源重组的方法可成功地敲除鼠伤寒沙门氏菌Χ4550的FlhD基因,并导致其鞭毛缺失,为鼠伤寒沙门氏菌鞭毛的功能研究奠定基础。
- 耿士忠潘志明方强胡娇陈祥焦新安
- 关键词：同源重组
- 我国地方品种姜曲海猪TLR5基因的克隆、表达及鉴定被引量：3
- 2012年
- 目的:克隆我国地方品种姜曲海猪TLR5基因,构建该基因的原核表达质粒,获得融合表达蛋白并鉴定其免疫特性,为进一步研制TLR5单克隆抗体(mAb)提供免疫原。方法:从全血中提取姜曲海猪的基因组,设计特异性引物,利用PCR方法扩增得到TLR5基因片段,PCR产物克隆到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒pET-TLR5,将重组表达质粒转化E.coli BL21,0.5 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定蛋白活性。结果:成功扩增出猪TLR5基因片段,大小为2 571 bp。酶切鉴定结果表明,猪的TLR5基因成功克隆入原核表达载体pET30a(+)中,重组质粒pET-TLR5在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE结果显示出相对分子质量(Mr)大小约95 200;Western blot结果表明,表达产物与兔抗小鼠TLR5 mAb具有良好的反应性。结论:成功克隆并表达具有较好免疫原性的猪TLR5分子,为其mAb的制备提供生物材料。
- 孙小林潘志明方强刘仲义焦新安
- 关键词：克隆原核表达
- 展呈H5N1亚型禽流感病毒M2e表位鞭毛蛋白的构建及其免疫原性
- 游猛潘志明方强耿士忠康喜龙杨芸焦新安
- 新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析被引量：4
- 2009年
- 应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段。经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F。重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F)。经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%。Western blotting结果显示,在相对分子质量46ku位置有特异性条带。动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P<0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性。
- 游猛潘志明耿士忠文科陈俊华张磊方强蔡雯婷焦新安
- 关键词：新城疫病毒融合蛋白原核表达免疫原性
- 猪及猪肉中沙门氏菌快速检测的研究进展被引量：7
- 2010年
- 沙门氏菌是常见的人和动物的重要病原菌之一，呈全球性分布。多种沙门氏菌均可感染猪，主要包括：海德堡沙门氏菌（salmonlla heidelberg）、华盛顿沙门菌（Salmonlla worthington）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonlla typhimurium）、
- 耿士忠潘志明刘杰刘志成方强焦新安
- 关键词：鼠伤寒沙门氏菌猪肉病原菌海德堡沙门菌
