孙剑
- 作品数：12 被引量：38H指数：4
- 供职机构：上海组织工程研究与开发中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市青年科技启明星计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 猪脂肪干细胞体外多向分化潜能的实验研究被引量：4
- 2007年
- 目的探讨猪脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs)在体外是否具有多向分化潜能。方法从猪项背部皮下脂肪组织中获取ADSCs,经过体外培养扩增至第2代分别进行成软骨细胞、成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化,通过免疫荧光和RT-PCR对其相关表型进行检测。结果猪ADSCs在体外成软骨诱导分化2周后有特异软骨基质Ⅱ型胶原和Aggrecan表达,RT-PCR检测显示有Ⅱ型胶原、Aggrecan和Sox-9mRNA的表达;体外成骨诱导分化2周后有与成骨相关的OPN、OCN和ONN表达;体外成脂肪诱导2周后,经油红染色显示细胞内有脂滴形成。结论猪ADSCs在体外具有向成软骨细胞、成骨细胞和成脂肪细胞分化的潜能。
- 伍耀豪崔磊尹烁刘广鹏孙剑
- 关键词：多向分化
- 应用酶联免疫法检测组织工程骨牛血清白蛋白残余量的实验研究被引量：2
- 2013年
- 目的检测常规体外构建的组织工程骨中牛血清白蛋白残余量,并探讨减少其残留量的方法。方法体外分离培养人骨髓基质干细胞,取第2代细胞(P2)接种于完全脱钙骨支架材料并成骨诱导培养2周,体外构建组织工程骨。成骨诱导液为含10%胎牛血清的条件培养液,并于检测前1天更换为无血清的条件培养液。待测组织工程骨先经1:100(v:v)生理盐水浸洗3次,然后加入磷酸盐缓冲液(PBS),37℃振荡浸提24h,获取浸提液。同法获取未接种细胞的单纯支架材料的浸提液作为对照组。采用酶联免疫法检测样品浸提液中牛血清白蛋白的残余量,比较两者牛血清白蛋白残余量的差异。结果经生理盐水洗涤3次后,洗涤液中的牛血清白蛋白含量明显降低。酶联免疫法测定的组织工程骨与单纯支架材料的牛血清白蛋白残余量分别为(15.57±5.82)ng和(14.85±5.06)ng,单位重量的牛血清白蛋白残余量分别为(0.254±0.088)ng/mg和(0.306±0.079)ng/mg,两组相比均无显著性差异(P>0.05,n=10)。结论酶联免疫法适用于组织工程骨中牛血清白蛋白残余量的检测。因为支架材料较细胞更易吸附牛血清白蛋白,现有条件下构建的组织工程骨牛血清白蛋白残余量仍然较高,需要继续探索降低其残余含量的新方法。
- 邹文焘刘广鹏孙剑崔磊
- 关键词：血清白蛋白酶联免疫吸附测定组织工程骨
- 玻璃化冻存骨髓基质干细胞的实验研究被引量：1
- 2009年
- 目的:骨髓基质干细胞(BMSCs)是构建组织工程化骨主要的种子细胞,实现BMSCs的深低温保存对骨组织工程具有重要意义。目前,玻璃化冻存是最有发展前景的冻存方法,因此希望通过改进玻璃化液和预处理条件来提高BMSCs的玻璃化冻存效果。方法:采用不同组成及浓度的玻璃化液在不同的预处理条件下对第2(P2)代成骨诱导的犬骨髓基质干细胞(cBMSCs)进行玻璃化冻存实验,通过复苏后的细胞存活率来选择一种理想的玻璃化液及适合的预处理条件,并在此基础上再与常规冻存的实验结果进行比较,同时考虑冻存过程对细胞成骨活性的影响。结果:将VS226作为玻璃化液,在0℃/5min的预处理条件下玻璃化冻存P2代成骨诱导的cBMSCs,与常规冻存后的细胞存活率相比无统计学差异,且冻存过程对此细胞的成骨能力没有影响。结论:采用VS226来玻璃化冻存BMSCs,可实现为骨组织工程提供大量种子细胞的目的。
- 尹宏宇孙剑刘广鹏崔磊曹谊林
- 关键词：深低温保存玻璃化冻存骨组织工程骨髓基质干细胞
- 人脐血间充质干细胞修复颅骨缺损的实验研究被引量：7
- 2010年
- 目的应用人脐血间充质干细胞（umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB—MSCs）复合脱钙骨材料构建组织工程化骨，修复裸大鼠颅骨标准缺损。方法体外扩增培养、成骨诱导人UCB—MSCs，采用AlizarinRed染色和钙离子半定量的方法测定细胞成骨分化能力。将第2代细胞接种在脱钙骨支架材料上继续诱导培养，扫描电镜检测细胞在材料上的生长状况。制备裸大鼠双侧颅骨全层标准缺损（直径5mm），一侧以细胞材料复合物修复作为实验侧（n=8）；另一侧以单纯脱钙骨材料修复作为对照侧（n=8）。术后6、12周取材，分别通过大体形态观察、显微CT（Micro—CT）、组织学方法检测颅骨缺损的修复效果。结果UCB—MSCs体外能够诱导分化为成骨细胞，且在脱钙骨支架材料上生长良好。Micro—CT检测显示术后6周实验侧有部分新生骨组织形成，12周时骨缺损修复率达（78．19±6．45）％，脱钙骨材料降解完全；对照侧6周时无明显新骨生成，12周时材料完全降解，骨缺损未修复。组织学检测显示12周时实验侧有较多成熟骨生成，为骨性愈合；对照侧骨缺损为纤维愈合。结论成骨诱导的人UCB—MSCs复合脱钙骨材料构建的组织工程化骨可修复裸大鼠颅骨全层标准缺损，有望成为新的组织工程骨种子细胞来源。
- 刘广鹏李宇琳孙剑崔磊张文杰曹谊林
- 关键词：间充质干细胞颅骨脱钙骨
- 成骨诱导的人骨髓基质干细胞生物安全性评价被引量：3
- 2008年
- 目的分析人骨髓基质干细胞在体外成骨诱导培养条件下,其染色体核型及端粒酶活性是否发生异常的改变,细胞是否产生致肿瘤性,为验证人骨髓基质干细胞作为骨组织工程种子细胞的安全性提供实验依据。方法采用常规细胞染色体G显带处理方法对3例成骨诱导培养的人骨髓基质干细胞样本进行核型分析,采用端粒酶活性PCR-ELISA检测法分析细胞的端粒酶活性,并通过裸鼠皮下致肿瘤试验对细胞的致肿瘤性进行研究。结果人骨髓基质干细胞体外成骨诱导培养至第7代,未发现染色体核型异常改变,相应的端粒酶活性也未出现异常增高。致肿瘤试验,在观察期内均未见结节形成或可疑病灶产生,符合国家医疗产品生物学评价标准的要求。结论人骨髓基质干细胞在体外长期成骨诱导培养条件下,染色体核型及端粒酶活性均未出现异常改变,且无致肿瘤性,符合作为骨组织工程种子细胞的生物安全性应用要求。
- 刘广鹏李宇琳孙剑周恒
- 关键词：骨髓基质干细胞生物安全性染色体核型
- 低温保存的GFP标记脂肪源性干细胞体外构建组织工程骨的研究被引量：3
- 2011年
- 目的研究经低温保存的GFP基因转染的犬脂肪源性干细胞(ASCs)在脱钙骨(DBM)支架材料上的生长特性及成骨分化潜能。方法胶原酶消化法分离获取并常规培养犬ASCs,用绿色荧光蛋白(GFP)重组逆转录病毒载体转染第2代ASCs,然后进行低温保存。-196℃液氮保存4周后,37℃复苏,测定细胞存活率。低温保存前后的ASCs接种DBM,用成骨诱导液诱导培养2周。激光共聚焦显微镜观察细胞在DBM上的生长情况,DNA定量(Hoechst33258法)测定细胞的体外增殖活性。通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙蛋白(OCN)含量,观察低温冻存对细胞在支架材料上成骨能力的影响。结果低温冻存复苏后细胞的存活率>90%,激光共聚焦显微镜显示细胞在材料上黏附生长良好。体外培养12d时细胞增殖达到平台期,ALP活性与OCN含量则随培养时间延长而不断上升,低温保存前后细胞的检测结果无显著差异(P>0.05)。结论低温保存对GFP标记的犬ASCs在脱钙骨上的体外生长及成骨能力无显著影响,可以作为组织工程骨的种子细胞。
- 刘广鹏孙剑李宇琳周恒崔磊
- 关键词：绿色荧光蛋白质类成体干细胞
- 低温冻存对人脂肪来源干细胞成骨能力影响的实验研究被引量：6
- 2010年
- 目的脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是组织工程种子细胞的重要来源之一。探讨低温保存对hADSCs体外生长特性及成骨分化潜能的影响,验证冻存后的ADSCs作为组织工程骨种子细胞的可行性。方法取自愿捐献的经脂肪抽吸术获取人脂肪组织,采用胶原酶消化法分离hADSCs。取第2代hADSCs置于-196℃液氮保存4周后,37℃复苏并测定细胞存活率。实验分为两组,实验组为低温保存的hADSCs,对照组为未经低温保存的hADSCs;均用成骨诱导液诱导培养。采用DNA定量(Hoechst33258荧光比色法)测定细胞体外增殖活性,ALP染色及茜素红染色法测定ALP活性和Ca2+含量,观察低温冻存对细胞成骨能力的影响。结果低温冻存复苏后的hADSCs存活率为90.44%±2.62%。两组细胞数量随成骨诱导时间延长不断增加,7d达平台期;ALP表达活性也不断增加,于成骨诱导11d达平台期,且2周时ALP染色均呈阳性;成骨诱导3周时两组茜素红染色均呈强阳性反应。两组各时间点细胞数量、ALP活性和Ca2+含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论低温保存的hADSCs体外生长及成骨能力未发生显著变化,可以作为组织工程骨的种子细胞。
- 刘广鹏李宇琳孙剑周恒崔磊
- 关键词：低温冻存脂肪来源干细胞成骨分化
- 绿色荧光蛋白标记的犬脂肪干细胞体外复合珊瑚材料的生长特性被引量：1
- 2006年
- 目的研究犬脂肪干细胞(AdiposeDividedStromalCells,ADSCs)作为种子细复合珊瑚材料体外培养的生长特性。方法分离犬ADSCs,成骨诱导并转染绿色荧光蛋白(GFP)后,复合珊瑚材料培养。检测细胞总数,激光共聚焦观察细胞形态。结果ADSCs-珊瑚复合物体外增殖良好。激光共聚焦显示培养2周后细胞呈老化形态。结论GFP转染不影响细胞传代、增殖。细胞-材料复合物体外培养7天后回植较为适宜。
- 孙剑李宇琳王衡健刘广鹏
- 关键词：绿色荧光蛋白脂肪干细胞STROMAL激光共聚焦成骨诱导
- 人骨髓基质干细胞染色体核型与端粒酶活性的检测分析被引量：1
- 2006年
- 目的分析人骨髓基质干细胞作为组织工程种子细胞,在长期体外扩增及大规模培养条件下,其染色体核型及端粒酶活性是否发生异常的改变。方法采用常规细胞染色体G显带处理方法及端粒酶活性PCR-ELISA检测法分析3例人骨髓基质干细胞样本。结果人骨髓基质干细胞体外培养至P10代,未发现染色体核型异常改变,相应的端粒酶活性也未出现异常增高。结论人骨髓基质干细胞在体外长期培养扩增的条件下,染色体核型及端粒酶活性未出现异常改变,符合种子细胞安全性的应用要求。
- 李宇琳周恒孙剑刘广鹏
- 关键词：人骨髓基质干细胞染色体核型端粒酶活性细胞体外培养体外长期培养细胞染色体
- 自体骨髓基质干细胞组织工程骨修复颅骨缺损的临床研究被引量：7
- 2009年
- 目的探讨人骨髓基质干细胞(hBMSCs)作为种子细胞的组织工程骨修复外伤后颅骨缺损的可行性。方法自2006年6月至2007年2月,共4例外伤后颅骨缺损患者,抽取患者骨髓,分离得到hBMSCs,体外扩增和成骨诱导后,将hBMSCs与部分脱钙骨复合,体外共培养1周后,手术植入颅骨缺损区。分别于术后1周和3个月、6个月进行临床和三维CT检查随访。结果术后1周,三维CT均显示骨缺损区被所植入的组织工程骨充填;术后3～6个月,CT显示组织工程骨形成并修复骨缺损,新生骨与骨缺损断端融合。高龄患者及骨缺损面积过大患者,组织工程骨体内成活率较差。结论通过选择适宜的病例,以自体hBMSCs作为种子细胞,运用组织工程技术可以在人体内形成稳定的组织工程骨并可用于修复颅骨缺损。
- 王有刚李新庆李春和吴智远崔磊刘广鹏李宇琳孙剑
- 关键词：骨髓基质干细胞颅骨缺损
