肖宇
- 作品数：10 被引量：24H指数：4
- 供职机构：第三军医大学基础部全军免疫学研究所更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 质粒表达型siRNA对SARS-CoV复制与感染干扰的初步研究被引量：5
- 2005年
- 目的 构建针对SARS CoV的特异性siRNA质粒 ,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染。方法 根据SARS CoV的全长基因序列 ,以 4个不同的部位为靶点 ,分别设计、合成含有 19nt干扰序列的一段寡核苷酸 ,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3 .1 H1载体中 ,构建表达siRNA的质粒。采用脂质体法将质粒转染VeroE6细胞 ,经潮霉素抗性筛选后 ,再对稳定表达的细胞进行细胞病变、病毒空斑形成和MTT实验 ,以观察干扰效应。结果 对所构建的质粒分别测序 ,确定其含有siRNA的序列与预期的特异性干扰序列一致。用不同浓度的SARS CoV感染转染质粒后的细胞 ,与阴性对照相比 ,其细胞病变减轻、活细胞显著增加 ,病毒空斑明显减少。结论 利用RNA干扰能有效的抑制SARS CoV在细胞中的复制 ,并对细胞有保护作用 ,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法。
- 李阳倪兵石辛甫王希良何仰东肖宇姜曼黎万玲吴玉章
- 关键词：SARS病毒RNA干扰小干扰RNA基因治疗
- SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究被引量：4
- 2003年
- 目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。
- 肖宇倪兵李晋涛李艳秋黎万玲王希良姜曼吴玉章
- 关键词：全长基因克隆SARS病毒基因疫苗严重急性呼吸综合症
- 中和性马抗体对SARS-CoV感染的防治作用被引量：3
- 2005年
- 目的探讨马抗SARSCoV中和性抗体是否对SARSCoV感染有防治作用。方法用SARSCoV(BJ01株)免疫马匹,从免疫马血清中制备IgGs及其F(ab’)2片段。通过细胞病变法(CPE)、MTT法和空斑形成实验(PFU)等方法,在体外培养的VeroE6细胞中检测F(ab’)2片段对SARSCoV感染的预防性和治疗性作用。再在Balb/c小鼠体内模型中,用CPE法和定量RTPCR方法检测该抗体的保护性效应。结果CPE、MTT和PFU三种方法证实来自三匹马的血清F(ab’)2的中和滴度均达到1∶1600以上。体内实验证实,50μg的F(ab’)2片段可以完全中和1×104TCID50SARSCoV。结论马抗SARSCoV抗体在体内外均能有效地中和SARSCoV和预防其感染宿主细胞,为马抗体将来在大的灵长类动物或人体内进行实验提供实验依据。
- 倪兵王希良王莉赵光宇石辛甫张松乐张良艳罗德炎黎万玲姜曼毛丽伟何仰东肖宇高闻达吴玉章
- 关键词：免疫中和抗体SARS-COV
- SARS-CoVS2蛋白基因的克隆及其在Vero E6细胞中的表达被引量：3
- 2004年
- 目的 克隆人SARS病毒S2蛋白分子的编码序列 ,并在VeroE6细胞上获得表达。方法 从人SARS病毒cDNA文库中用PCR技术克隆编码SARS病毒S2蛋白的片段。将它插入质粒载体pVAX1中构建重组S2 pVAX1真核表达载体 ,并对插入片段序列进行测序。采用脂质体法转染VeroE6细胞 ,用Westernblotting检测SARS CoVS2蛋白的表达情况。结果 用PCR方法扩增出一个 1845bp的基因片段 ,并插入pVAX1载体中 ,成功构建出重组S2表达载体 ,经测序证实克隆的S2片段阅读框正确完整。将其转染的VeroE6细胞经WesternBlotting检测获得一条特异性目的蛋白条带。结论 成功克隆基因并获得表达S2分子的VeroE6细胞系。
- 姜曼王希良李晋涛倪兵黎万玲肖宇吴玉章
- 关键词：SARS病毒克隆真核表达
- SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达被引量：5
- 2003年
- 目的 克隆表达SARS CoVS1蛋白 ,构建SARS基因疫苗。方法 从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS CoVS1蛋白的编码序列 ,将该序列克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。采用脂质体法转染VeroE6细胞 ,用Westernblot检测S1蛋白的表达。结果 PCR方法扩增出 2 0 0 0bp左右的基因片段 ,插入pVAX1构建重组表达载体后 ,经序列测定证实扩增的片段为SARS CoVTor 2株S1蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞 ,收集细胞总蛋白 ,Western检测获得特异蛋白带。结论 成功克隆并表达了SARS CoVS1蛋白 。
- 黎万玲倪兵李晋涛李艳秋王希良姜曼肖宇吴玉章
- 关键词：基因克隆
- RNA干扰能有效抑制SARS相关冠状病毒复制被引量：4
- 2004年
- 李阳倪兵石辛甫吴玉章王希良何仰东肖宇姜曼黎万玲
- 关键词：RNA干扰SARS冠状病毒
- PD-L1蛋白的表达、纯化与鉴定
- 2005年
- 目的克隆人PD -L1的基因,纯化Flp -InCHO系统表达PD- L1蛋白。方法用RT- PCR方法制备PD- L1基因,以哺乳细胞高效表达质粒载体pSec/WG为载体构建重组PD- L1/pSec/WG质粒,重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化转染Flp- InCHO细胞收集上清,G蛋白亲和层析法纯化蛋白。用免疫印迹法鉴定转化细胞所分泌上清的PD -L1基因的表达。结果正确构建了PD- L1/pSec/WG重组质粒,并且在转化细胞所分泌的上清中检测出了PD -L1基因的表达。亲和层析法成功纯化出PD- L1蛋白,分子量为40×103。结论成功地构建了PD -L1/pSec/WG重组质粒,纯化出PD -L1蛋白,可进行下一步mAb制备,进一步研究其功能。
- 毛丽伟倪兵姜曼黎万玲肖宇吴玉章
- 关键词：PD-L1RT-PCR克隆
- 基于α-病毒复制酶的基因疫苗对人黑色素瘤的免疫作用
- 2005年
- 目的研究基于α-病毒复制酶的人黑色素瘤基因疫苗免疫学作用。方法建立及鉴定人/鼠嵌合模型(trim-era),将基于α-病毒复制酶的mage-3基因疫苗免疫动物,检测动物体内特异抗体滴度;用标准4h51Cr释放实验检测动物体内特异CTL活性。结果FACS分析显示,trimera小鼠腹腔细胞中人白细胞占总细胞的88·84%,脾脏细胞中人白细胞的比例占57%,同国外文献报道一致。基于α-病毒复制酶的重组基因疫苗mage-3/pSMART2a对trimera小鼠免疫后,小鼠腹腔细胞的CTL在效靶比为100∶1时杀伤率达到70%左右,此时的对照组mage-3/pCI-neo组最大杀伤率为40%左右。ELISA结果显示,重组基因疫苗mage-3/pSMART2a组产生的mage-3抗原特异性抗体效价达到1∶512,mage-3/pCI-neo组为1∶256。结论成功建立了人/鼠嵌合模型,并在动物体内激发出针对人黑色素瘤基因疫苗的初次免疫应答。
- 倪兵姜曼黎万玲毛丽伟何仰东肖宇吴玉章
- 关键词：复制酶基因疫苗人黑色素瘤
- BTLA蛋白胞外区片段的制备及鉴定
- 2005年
- 目的 克隆人的BTLA蛋白分子的基因胞外区片段(ExtracellularregionofBTLA ,exBTLA) ,并在Flp InCHO系统表达、纯化,用于单克隆抗体的制备或直接进行功能研究。方法 用RT PCR方法制备exBTLA基因,以哺乳细胞高效表达质粒载体pSec WG为载体构建重组融合exBTLA IgFc pSec WG质粒。重组体经双酶切鉴定后,再通过测序鉴定克隆的正确性。采用脂质体法将重组质粒转染Flp InCHO细胞,G蛋白亲和层析法纯化蛋白。用Westernblotting检测BTLA基因胞外区表达的特异性。结果 正确构建了exBTLA pSec WG重组质粒,并在转染细胞所分泌的上清液中检测出了蛋白片段的表达。利用亲和层析法成功纯化出特异的exBTLA蛋白。结论 成功地构建了exBTLA pSec WG重组质粒,纯化出exBTLA蛋白,为下一步mAb制备及其功能研究提供实验依据。
- 毛丽伟倪兵姜曼黎万玲肖宇吴玉章
- 关键词：BTLART-PCR
- PD-L1 mAb的制备、鉴定及其特性的研究被引量：2
- 2005年
- 目的 制备抗程序化死亡配体 1(ProgrammedDeath Ligand 1,PD L1)的mAb杂交瘤细胞系并对其分泌的抗体特性进行研究。方法 用我室纯化的PD L1 IgG4Fc融合蛋白免疫Balb c小鼠 ,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2 0进行融合 ,经筛选和克隆化后 ,建立杂交瘤细胞系。以Western blot等方法研究抗体特性。结果 得到 3株能够稳定分泌抗体 ,效价高的杂交瘤细胞系 2D10、1C3和 1A6 ,Western blot显示 2D10、1C3和 1A6能与PD L1(Mr 为 5 80 0 0 )结合。结论 得到杂交瘤细胞系稳定分泌的mAb ,在抗病毒免疫、抗肿瘤反应和自身免疫性疾病的免疫诊断和
- 毛丽伟倪兵姜曼黎万玲肖宇吴玉章
- 关键词：PD-L1杂交瘤单克隆抗体WESTERNBLOT
