郑娟
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
- 供职机构：聊城大学药学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 重组GluV8的克隆表达、纯化及酶学性质研究被引量：3
- 2014年
- 谷氨酰内切酶在生物制药及检测中应用较多,但来源受限,将全基因合成的金黄色葡萄球菌来源的谷氨酰内切酶功能区部分对应的基因进行改造后,克隆入表达载体pGEX-4T-2,导入E.coli BL21(DE3),重组蛋白以可溶性形式表达。采用亲和层析等纯化步骤对重组蛋白进行纯化,用底物Z-Phe-Leu-Glu-pNA(L-2135)对重组蛋白的酶学性质进行了研究,用HPLC、LC-MS/MS检测方法对酶切融合蛋白的位点特异性进行了鉴定。结果表明该酶的相对活性为1568U/mg,最适作用温度为42℃、最适作用pH为8.0,在pH 9.0,50℃时仍有较高的酶活,将该酶与胰酶酶切融合蛋白所得肽段结合能够提升质谱检测结果的精确度。以上结果表明该重组酶具有良好的应用前景。
- 段树燕郭怀祖李晶郑娟赵自叶张大鹏王皓
- 关键词：克隆酶学性质
- 重组内肽酶AspN的原核表达纯化及活性鉴定
- 蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸残基的N-端肽键,广泛应用于蛋白的肽图谱及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN主要来源于脑膜脓毒性黄杆菌和假单胞杆菌两种细菌的分泌,产量较低,制备困难,成本高,极...
- 郑娟
- 关键词：原核表达分离纯化活性鉴定
- 文献传递
- 重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定
- 2015年
- 蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶Asp N所对应的基因克隆入表达载体p ET32a,导入E.coli BL21(DE3),首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达,亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe(NO2)-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶Asp N具有与标准品基本一致的酶切活性,能够较好地应用于生物和制药领域。
- 郑娟郭怀祖李晶段树燕赵自叶张大鹏郭尚敬王皓
- 关键词：原核表达纯化活性鉴定
- 半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化及活性鉴定
- 2014年
- 酿脓链球菌来源的免疫球蛋白G降解酶(immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes,IdeS)是一种典型的半胱氨酸水解酶,可以在抗体铰链区的特定位点进行酶切,使IgG水解为完整的F(ab)2片段和Fc片段,由于其独特的酶活特异性和高活性,IdeS可以作为工具酶应用于IgG的亚单位制备、结构分析及表征分析。利用双标签(GST-tag及His6-tag)表达系统在E.coli中高效表达了可溶性重组蛋白酶GST-IdeS-His6,并在IdeS的氨基端与GST之间加上肠激酶酶切位点,以利于标签的去除。再利用亲和层析的纯化方法对目的蛋白进行纯化。使用SDS-PAGE、HPLC-SEC、LC-MS对纯化后的IdeS进行分析和鉴定。结果表明:本系统所表达的蛋白酶IdeS得率高,每1L菌液纯化可获得约25mg纯度为90%以上的蛋白酶IdeS,将此蛋白酶与抗体IgG以1∶100(m/m)比例混合,于37℃反应30min,即可酶切完全。能够满足蛋白质结构分析中对蛋白酶的高质量要求,并且适用于抗体类药物的表征分析。同时,蛋白酶IdeS也可以应用于生物仿制药、生物改良药和新一代抗体以及Fc-融合蛋白的研究。
- 许静赵自叶徐进郭怀祖郑娟段树燕彭晓云王皓
- 关键词：原核表达纯化
- 重组可溶性人IL-6的原核表达纯化和活性鉴定
- 2013年
- 使用大肠杆菌BL21(DE3)重组表达可溶性人IL-6并对其进行纯化和活性鉴定。以人激活T细胞总RNA为模板,逆转录PCR扩增人IL-6的基因片段并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件获得可溶性表达目的蛋白。细菌裂解上清经镍金属螯和层析纯化,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,western blot鉴定其免疫原性,并通过IL-6依赖的细胞株T1165分析重组蛋白的活性。成功构建了pET32a(+)/IL-6表达载体,并获得了可溶性表达的重组人IL-6蛋白。SDS-PAGE显示,其分子量约为21kD,可被抗IL-6抗体特异性识别,并且该重组蛋白可刺激IL-6依赖的细胞株T1165增殖,比活性与标准品一致,约为1×106 U/mg。本实验获得了可溶性高表达的重组人IL-6蛋白,为进一步研究人IL-6奠定了基础。
- 刘彩艳赵自叶郑娟段树燕郭怀祖徐进王皓
- 关键词：IL-6原核表达纯化活性鉴定
