郭强
- 作品数：4 被引量：9H指数：2
- 供职机构：中山大学药学院微生物与生化制药实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定被引量：3
- 2013年
- 目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型。方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定。构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株。采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化。建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤。结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光。胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型。结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具。
- 方瑞郭强杜军
- 关键词：SNAIL黑色素瘤上皮-间质转化
- 人源TNFα的原核表达及活性测定被引量：1
- 2014年
- 目的:利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法:利用PCR技术,从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列,并在其上游添加SUMO标签,与原核表达载体pET28a连接,构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21(DE3)工程菌中表达融合蛋白,经Ni-NTA纯化体系纯化,切除SUMO标签,纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性,以测定TNFα的生物学活性。结果:成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21(DE3)工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8μg/ml。结论:成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα,经表达、纯化、酶切及再纯化,获得有生物活性的hTNFα蛋白,为深入研究和利用hTNFα奠定基础。
- 李翠琳张帆陈丹扬王昊郭强杜军
- 关键词：TNFΑSUMO原核表达生物学活性
- Nodal诱导小鼠黑色素瘤B16细胞上皮–间质转化及体外迁移和侵袭被引量：2
- 2013年
- 考察转化生长因子-β家族成员Nodal蛋白诱导小鼠黑色素瘤B16细胞发生上皮–间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)及促进其迁移和侵袭能力的作用。该研究采用活性重组Nodal蛋白刺激体外培养的B16细胞,观察细胞形态变化,利用蛋白免疫印迹法及免疫荧光染色法检测EMT标志物的表达及定位。通过Transwell小室实验分析Nodal对B16细胞迁移和侵袭的影响。检测Nodal刺激后,AKT、ERK相关信号通路的活化状态,并考察Nodal受体抑制剂SB431542对Nodal诱导的细胞EMT过程及信号活化的抑制作用。研究结果显示,Nodal可引起B16细胞发生EMT,并具有时间和浓度依赖性。Nodal刺激后的细胞其迁移和侵袭能力都明显增强。此外,Nodal还可引起AKT、ERK信号通路的活化。以上作用均能被SB431542所抑制。该研究为深入研究Nodal在黑色素瘤恶性转化过程中的生物学作用和分子机制奠定了工作基础。
- 方瑞郭强张帆由振源杜军
- 关键词：NODAL上皮间质转化黑色素瘤
- 稳定高表达和干扰Nodal基因黑色素瘤细胞株构建及EMT表型鉴定被引量：4
- 2014年
- 目的:构建稳定过表达及稳定干扰Nodal的黑色素瘤细胞B16细胞株,并鉴定其EMT表型,用于研究Nodal诱导黑色素瘤EMT的现象及机理。方法:将过表达小鼠Nodal基因的质粒pL-tdTomatomNodal,及携带有干扰Nodal基因序列的shRNA质粒pGFP-V-RS-Nodal,分别转染B16细胞。通过抗性筛选富集,阳性克隆挑选及扩大培养,获得稳定转染细胞株B16/dT-mNodal及B16/sh-Nodal。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Nodal的过表达及敲除情况和EMT标记物的表达情况。结果:两株细胞均构建成功,B16/dT-mNodal细胞株发出强烈红色荧光,胞内Nodal水平上调明显,并呈现间质细胞特性;B16/sh-Nodal细胞株发出强烈绿色荧光,胞内Nodal水平下调明显,并呈现上皮细胞特性。结论:成功构建稳定过表达Nodal及稳定干扰Nodal的B16细胞株,并构建Nodal影响B16细胞EMT过程的模型,为研究Nodal在黑色素瘤EMT过程中的作用提供了重要的实验工具。
- 权美玉郭强张坤水方瑞李翠琳杜军
- 关键词：NODAL黑色素瘤基因沉默EMT
