何升东
- 作品数：10 被引量：21H指数：3
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- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
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- CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆的体外生长特性观察被引量：1
- 2009年
- 采用MTT比色法、碘化丙啶染色法和直接免疫荧光双标记法分别观察4个CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)克隆(代号分别为Ⅱ～Ⅴ)的生长曲线、细胞周期以及表皮干细胞相关表型,预期筛选出体外生物学性状良好的表皮种子细胞克隆。结果显示,与未转染的HaCaT细胞(代号为Ⅰ)比较,Ⅲ～Ⅴ在体外培养第5、6天的光密度值显著降低;Ⅲ和Ⅳ的G2+M期显著增多;Ⅳ和Ⅴ表达CD49f^+CD71-的百分率显著升高,而表达CD49f^+CD71^+、CD71^+的百分率显著降低。可见,4个CCL20基因敲低型HaCaT细胞克隆中仅有Ⅱ表现出与未转染HaCaT类似的体外生长特性,该克隆有可能成为构建低免疫原性组织工程皮肤的表皮种子细胞。
- 何斌彭代智何升东周新刘敬王勇王丽华郑必祥左海斌
- 关键词：角质形成细胞细胞周期
- 不同质粒导入人角质形成细胞的实验研究
- 目的：研究不同质粒导入人角质形成细胞的方法和效率.方法：将四种不同分子量的质粒采用脂质体、阳离子多聚物、电穿孔及慢病毒四种转染方法导入人永生化角质形成细胞系HaCaT,同时以人胚胎肾细胞系293FT为对照,荧光显微镜观察...
- 王丽华彭代智刘敬周新王勇何升东何斌郑必祥董征学
- 不同质粒导入人角质形成细胞的实验研究
- 目的:研究不同质粒导入人角质形成细胞的方法和效率。方法:将四种不同分子量的质粒采用脂质体、阳离子多聚物、电穿孔及慢病毒四种转染方法导入人永生化角质形成细胞系HaCaT,同时以人胚胎肾细胞系293FT为对照,荧光显微镜观察...
- 王丽华彭代智刘敬周新王勇何升东何斌郑必祥董征学
- 文献传递
- 颗粒状脱细胞真皮基质的形态学特征及理化性能体外研究被引量：4
- 2011年
- 目的研究颗粒状脱细胞真皮基质(particulate acellular dermal matrix,PADM)的体外形态学特征与理化性能。方法收集SD大鼠背部皮肤样本,采用本实验室的脱细胞方法制备片状脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix,ADM)并分析其内胞核和DNA残留情况。将片状ADM切割成不同规格的PADM,并结合大体观察、组织学分析、电镜技术、激光粒度分析仪和傅里叶变换红外光谱仪检测其外观轮廓、形态学、粒径分布和胶原分子结构。并将其复合人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)体外培养24 h,观察PADM与HUVEC的黏附情况。结果脱细胞方法有效降低了ADM的DNA含量[(1.51±0.37)μg/mgvs(0.30±0.09)μg/mg]。制备的PADM为白色颗粒,外形近似于长方体或立方体,显微镜下HE染色观察显示颗粒内部胶原纤维束结构疏松。扫描电镜显示颗粒断面结构疏松,透射电镜显示胶原原纤维周期性横纹结构和均匀分布的胶原原纤维间隙。激光粒度分析仪检测显示其粒度分布集中,例如,规格为0.2 mm的PADM,其80%(d0.1～d0.9)的粒径分布于233～487μm。FTIR结果显示,PADM分别在1 659、1 549、1 239 cm-1处出现的特征吸收峰,表明其保留了胶原分子的α-helix、β-sheet和β-turn二级结构,且体外HUVEC较易黏附于PADM。结论室温条件下,切割法制备的新型PADM形态规则,粒径分布集中,胶原纤维束形态和胶原分子的二级结构保存良好。
- 左海斌彭代智郑必祥何升东周新刘敬
- 关键词：细胞外基质粒径分布
- CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果
- 目的：采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系(HaCaT),筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果.方法：用CaCl2法将已构建好的3种pHSER-CCL20-sh...
- 彭代智周光前王丽华刘敬周新王勇何升东何斌郑必祥董征学
- CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果
- 目的:采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系(HaCaT),筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果。方法:用CaCl法将已构建好的3种pHSER-CCL20-shR...
- 彭代智王丽华刘敬周新王勇何升东何斌郑必祥董征学周光前
- 文献传递
- CCL20基因敲低型组织工程皮肤种子细胞的克隆筛选及其干扰效果被引量：3
- 2009年
- 目的采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染人永生化角质形成细胞系（HaCaT），筛选出稳定干扰CCL20基因表达的细胞克隆并检测其干扰效果。方法用CaCl2法将已构建好的3种pHSER—CCL20-shRNA—GFP载体（pHCG-1和pHCG-2为CCL20基因特异性，pHCG-3为CCL20基因错配）转染293FT包装出慢病毒颗粒，流式细胞术测定其病毒滴度。用G418压力筛选慢病毒感染的HaCaT，荧光定量RT—PCR和ELISA法分别检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平，以判断其特异性干扰效果。结果三种慢病毒载体所包装出的慢病毒滴度分别为7．08×10^5转导单位（TU）／ml、1．88×10^5TU／ml和2．08×10^5TU／ml；感染后的HaCaT经过G418筛选5～8周，获得4株CCL20基因特异性的细胞克隆（HaCaT-1、HaCaT-2、HaCaT-3和HaCaT-4）及2株CCL20基因错配对照的细胞克隆（HaCaT-5和HaCaT-6）。经荧光定量PCR和ELISA法检测显示，4株CCL20基因特异性细胞克隆均具有稳定干扰效果，不仅能显著地下调CCL20基因的mRNA表达（其抑制率分别为81．0％、89．0％、81．3％、77．2％），而且明显地减少CCL20蛋白分泌（其抑制率分别为70．0％、86．1％、88．1％、90．7％）。结论采用重组慢病毒CCL20基因特异性shRNA载体感染HaCaT可以筛选出具有长期稳定表达RNA干扰效应的CCL20基因敲低型人永生化角质形成细胞克隆，将可能为低免疫排斥反应异基因组织工程皮肤的构建提供种子细胞。
- 王丽华彭代智刘敬周新王勇何升东何斌郑必祥董征学周光前
- 关键词：RNA干扰慢病毒属种子细胞
- 人角质形成细胞基因导入效率的影响因素研究被引量：2
- 2009年
- 目的了解不同大小质粒和不同基因转染法对人KC基因导入效率的影响。方法采用脂质体转染法、阳离子多聚物转染法、电穿孔联合细胞核转染试剂转染法、慢病毒感染法，分别将不同大小的质粒[pSUPER-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、pEGFP—N2、pHSER-绿色荧光蛋白（GFP）、ploxP-EGFP]导入人永生化KC株HaCaT细胞和人胚肾细胞株293FT细胞（后者为对照）。于倒置荧光显微镜下观察GFP的表达，计算转染率。结果（1）采用脂质体转染法可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率1．0％～3．3％）及293FT细胞（转染率80．0％～84．7％）。（2）阳离子多聚物转染法亦可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率为1．0％～3．7％）和293FT细胞（转染率81．3％～86．7％）。（3）采用电穿孔联合细胞核转染试剂转染法，可以将2种较小片段质粒pSUPER—EGFP和pEGFP-N2导入HaCaT细胞，转染率分别为22．3％和19．0％；而2种较大片段质粒pHSER-GFP和ploxP-EGFP的转染率分别为4．0％和3．3％。（4）pHSER-GFP经慢病毒包装后，导入HaCaT细胞的转染率高达97．0％，明显优于前3种转染法。结论脂质体转染法、阳离子多聚物转染法较难将外源性基因导入人KC，慢病毒感染法的转染率明显优于电穿孔联合细胞核转染试剂转染法；
- 王丽华彭代智周新刘敬王勇何升东何斌郑必祥董征学
- 关键词：转染质粒角质形成细胞基因治疗
- CCL20基因短发夹RNA表达载体转染人胚胎肾细胞的干扰效应
- 2009年
- 目的观察人CCL20基因短发夹RNA表达载体(pSCS-EGFP)转染人胚胎肾细胞(293FT细胞),以及对其表达CCL20 mRNA和分泌CCL20蛋白的抑制作用。方法用脂质体转染法把构建成功的3个pSCS-EGFP质粒(其中pSCS-EGFP-1为CCL20基因错配型,pSCS-EGFP-2和pSCS-EGFP-3均为CCL20基因特异型)转染到293FT细胞,24h后分别用荧光显微镜照相和流式细胞仪检测293FT细胞的转染率。将未转染及分别转染3种质粒的293FT细胞培养48h,用TNF-α和IL-1β刺激培养24h后,分别用荧光定量RT-PCR和ELISA法检测CCL20基因mRNA和蛋白的表达水平,计算其抑制率。结果3种质粒(pSCS-EG-FP-1～3)转染293FT细胞的效率分别为(73.8±5.3)%、(50.0±4.8)%、(56.8±2.9)%。加细胞因子刺激下,3种载体对293FT细胞表达CCL20 mRNA相应的抑制率分别为(18.53±34.44)%、(90.40±3.94)%和(92.50±6.15)%;上清中CCL20蛋白相应的抑制率分别为(14.88±17.39)%、(71.76±8.27)%和(88.56±1.74)%。未加细胞因子刺激下,CCL20 mRNA的相应抑制率分别为(61.37±11.72)%、(84.33±12.78)%和(80.27±15.84)%;CCL20蛋白的相应抑制率分别为(19.91±48.12)%、(-27.87±50.24)%和(87.21±8.36)%。结论特异性CCL20shRNA表达载体能明显下调细胞因子刺激人胚胎肾细胞表达CCL20 mRNA及蛋白,该载体为研究肾移植排斥反应等CCL20相关性肾脏疾病的治疗提供了一定的实验基础。
- 何升东彭代智何斌刘敬周新王勇王丽华郑必祥左海斌
- 关键词：CCL20RNA干扰短发夹RNA
- 巴马小型猪与人真皮的组织形态学和生物力学基本特征比较研究被引量：12
- 2010年
- 目的通过比较研究巴马小型猪与人皮肤在真皮组织结构、胶原类型和生物力学性能方面的差异,寻找猪脱细胞真皮基质临床应用受限相关的组织结构及生物力学原因。方法收集巴马小型猪与人的背部全层皮肤样本,采用大体观察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩红染色、VVG染色、扫描电镜及透射电镜等方法,显微照相后进行形态学观察和图像分析软件测量,同时利用材料试验机检测真皮生物力学性能。结果与人皮肤比较,光镜下可见巴马小型猪皮肤的真皮胶原纤维束更粗[(39.29±10.17)μmvs(17.21±5.20)μm](P=0.000 3),而其间隙率更低[(19.01±1.55)%vs(32.36±1.28)%](P=0.029);真皮弹性纤维分布、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量及其比值也与人真皮有明显差异(P<0.05);扫描电镜显示巴马小型猪真皮的胶原纤维束排列紧密、束间孔隙小,透射电镜显示巴马小型猪真皮的胶原原纤维较细,横纹的周期更长;生物力学检测显示巴马小型猪真皮的最大应变[(0.52±0.05)mm/mm]低于人真皮[(0.80±0.06)mm/mm](P=0.003),而弹性模量[(69.65±12.16)MPa]和最大应力[(20.72±1.49)MPa]高于人真皮[分别为(44.23±4.63)、(11.85±0.19)MPa](P=0.028,P=0.001)。结论巴马小型猪的真皮与人真皮差异较大,从组织形态学的角度提示猪脱细胞真皮基质不是修复人体真皮缺损的最佳生物材料。
- 郑必祥彭代智左海斌何斌王丽华何升东王勇周新刘敬
- 关键词：真皮组织形态学基质生物力学
