杜谦
- 作品数：22 被引量：35H指数：4
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项教育部“新世纪优秀人才支持计划”陕西省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 猪圆环病毒2型ORF1、ORF2和ORF3原核表达和多克隆抗体的制备被引量：3
- 2015年
- 猪圆环病毒2型(porcine Circovirus type 2,PCV2)感染给养猪业造成巨大的经济损失,而PCV2ORF1、ORF2和ORF3与PCV2的复制、免疫原性及致病机理密切相关。本研究制备PCV2ORF1、ORF2和ORF3多克隆抗体,为进一步研究PCV2ORF1、ORF2和ORF3的功能提供材料。依据PCV2全基因组序列,分别设计针对PCV2ORF1、ORF2和ORF3编码基因的特异性引物,PCR扩增后,克隆入原核表达载体pET-32a的BamHⅠ/NcoⅠ和HindⅢ位点之间,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组原核表达载体分别命名为pET-ORF1、pET-ORF2和pET-ORF3。重组质粒分别转化E.coli BL21菌株,1 mmol/L IPTG诱导表达ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白,SDS-PAGE测定结果表明其相对分子质量分别约为52 000、39 000和29 000。大量诱导重组蛋白表达后,回收目的蛋白条带、匀浆后免疫新西兰大白兔,制备兔抗PCV2ORF1、ORF2和ORF3重组蛋白血清。兔抗血清纯化后,Western blot检测抗血清与重组蛋白的特异性结合情况及其效价,证明所制备多克隆抗体均具有较强的特异性,效价均高于1∶10 000。
- 陈禹杜谦霍瑞超王莉莉童德文黄勇
- 关键词：PCV2ORF2ORF3多克隆抗体
- 一种NPM1结合区域突变的PCV2病毒及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种NPM1结合区域突变的PCV2病毒及其制备方法和应用。将野生型PCV2毒株衣壳蛋白的两个位点147R及148H突变，使得突变PCV2通过感染性克隆进行病毒拯救，获得复制能力低于野生型PCV2的突变毒株。本...
- 黄勇童德文韩聪杜谦朱磊
- 七种猪常见病毒核酸磁-纳米微粒可视化快速检测技术的建立与应用
- 2023年
- 随着集约化养殖业的发展,规模化养猪场对于病原的早期快速检测需求逐步增高,本研究旨在建立针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪细小病病毒(porcine parvovirus,PPV)等7种常见病毒病病原感染的广谱磁纳米微粒可视化(ultrasensitive nanoparticle visualization detection,UNVs)现场检测技术。根据不同病毒的复制酶区域的高度保守区域,设计探针和引物,通过探针的筛选和条件的优化,得到具有特异性强、富集效率和杂交效率高的目的病原基因序列特异性识别探针(富集探针和杂交探针),分别与四氧化三铁磁性微粒和纳米金偶联,制备成针对每种病原的特异性功能化磁珠和功能化纳米金。以功能化磁珠为载体富集核酸信号,功能化纳米金做桥梁放大信号,使用双探针同时检测病原核酸,结合碱性磷酸酶的酶促可视化反应检测信号,建立针对猪PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV等7种病毒的现场可视化UNVS便捷诊断技术。结果显示,筛选设计的核酸探针与猪的其它病原无交叉反应,特异性良好。建立的针对PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV病原的UNVs可视化检测技术,检测限为103 copies·mL^(-1)(血清样本)或103 copies·g^(-1)(粪便样本),基本上达到了PCR或RT-PCR的检测敏感度,灵敏度组内与组间最大变异系数均小于5%,显色结果稳定,无较大差异,有良好的重复性,单个样本的检测可在4 h以内完成。应用该技术和PCR检测对来自陕西省的499份临床样品(疑患有PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV的猪的血清、粪便样品)进行同步检测和�
- 赵永攀郑芳芳尹俊卿杜谦童德文黄勇
- 关键词：猪病毒病碱性磷酸酶可视化
- 生物素标记重组猪圆环病毒2d基因型毒株感染性克隆的构建与鉴定
- 2022年
- 本试验旨在获得临床上逐渐增多的猪圆环病毒2d基因型毒株(PCV2d),并对其引入生物素标记。首先从陕西咸阳某临床发病猪场采集了2头发病仔猪和15头未发病仔猪的组织样本,对其进行猪圆环病毒2型(PCV2)检测,并对阳性样本进行测序及序列比对,将获得的PCV2d基因型毒株基因组orf 2中226~246 bp序列替换为生物素受体肽(BAP)编码序列并克隆入质粒载体,同时稳定构建表达原核生物素连接酶(BirA)的PK15细胞系,将替换有BAP的PCV2d基因组酶切并环化后转染稳定表达BirA的PK15细胞,连续盲传5代后鉴定获得的重组病毒。结果显示,检测的组织样本中共有5头仔猪的样本为PCV2阳性,其中1份样本为PCV2d基因型,4份样本为PCV2b基因型;在获得BAP序列替换的PCV2d,构建重组质粒T-PCV2d-BAP和稳定表达BirA的PK15细胞系后,将环化的PCV2d-BAP转染稳定表达BirA的PK15细胞并盲传5代,经PCR和Western blot检测均为PCV2阳性,且能被链酶亲和素识别。本试验成功获得的生物素标记重组PCV2d基因型毒株为后续探究PCV2d基因型毒株免疫逃避机制提供一个非常有效的工具。
- 林小枫刘梅雪袁玮艺张琼歌朱磊杜谦
- 关键词：猪圆环病毒2型感染性克隆
- 2010-2012年陕西地区猪圆环病毒2型分子流行病学调查被引量：12
- 2013年
- 【目的】调查陕西地区猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)的分子流行病学变化趋势,为进一步预防和治疗猪圆环病毒病提供参考。【方法】于2010-2012年采集陕西西安、咸阳、宝鸡、榆林和延安等地区发病猪群中的141份样品。首先,采用PCR检测样品中PCV2感染情况;然后,通过基因型特异的PCR,检测PCV2阳性样品中PCV2a和PCV2b亚型的感染情况;最后,扩增、克隆和测序PCV2 ORF2基因编码序列,并通过生物信息学软件统计分析所获得基因序列的进化情况。【结果】141份样品中,117份检测为PCV2阳性,阳性率达82.9%,其中的33份病死猪样品中有32份检测为PCV2阳性。基因型特异的PCR检测结果显示,117份PCV2阳性样品中单感染PCV2b的为59份,单感染PCV2a的为11份,另外47份样品为PCV2a和PCV2b混合感染。对32份病死猪PCV2阳性样品的PCV2 ORF2基因序列进行比对分析,结果表明,12份为PCV2b-1A/1B亚型,16份为PCV2b-1C亚型,4份为PCV2a亚型。对各亚型ORF2氨基酸序列的分析结果表明,氨基酸的变异位点主要存在于8-47,59-101,134-169,180-210这4个区域。【结论】陕西地区猪群PCV2感染严重,并且PCV2b-1A/1B和PCV2b-1C亚型是主要流行毒株,氨基酸变异位点主要存在于Cap蛋白潜在表位区。
- 邵萌吕亚辉杜谦时乐黄勇童德文
- 关键词：猪圆环病毒2型ORF2流行株
- 一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用。对PCV2DNA中的GAS样基序进行突变，使得突变的PCV2DNA在病毒复制中不能与STAT5蛋白结合，并通过病毒拯救获得复制能力远低于野生型PCV2毒株...
- 黄勇童德文韩聪杜谦朱磊
- 永生化山羊滋养层细胞系的建立及其生物学特性分析
- 滋养层细胞在胚胎着床和胎盘形成过程中发挥重要作用,很多致病因素能够引起滋养层细胞的功能紊乱导致胚胎着床失败或流产,获得一株能够稳定传代的山羊滋养层细胞用于体外研究具有十分重要的意义。本研究分离、纯化原代山羊滋养层细胞,转...
- 董峰黄勇赵晓民杜谦童德文
- 关键词：滋养层细胞生物学特性人端粒酶逆转录酶基因
- 文献传递
- 一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用
- 本发明公开了一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用。对PCV2DNA中的GAS样基序进行突变，使得突变的PCV2DNA在病毒复制中不能与STAT5蛋白结合，并通过病毒拯救获得复制能力远低于野生型PCV2毒株...
- 黄勇童德文韩聪杜谦朱磊
- 文献传递
- 畜禽常见衣原体病流行情况及其诊断技术研究进展
- 2024年
- 衣原体是一种重要的人兽共患专性胞内寄生性病原微生物,能广泛地感染多种家畜、禽类以及人类,主要导致繁殖障碍性疾病,给世界各地畜禽养殖业造成了巨大经济损失,对公共卫生也构成了威胁。明确畜禽常见衣原体病的流行情况并做好早期诊断成为防控该病流行的关键。论文就畜禽常见衣原体病的流行情况以及临床症状进行综述,并从病原学、血清学以及分子生物学诊断3个方面对国内外畜禽衣原体病的诊断方法进行归纳总结,以期为有效防控畜禽衣原体病提供参考。
- 马梦雨程一佼朱少睿李忠军张飞杜谦童德文
- 关键词：畜禽衣原体
- 传染性法氏囊病病毒YL株VP2基因的克隆、序列分析及原核表达被引量：6
- 2010年
- 克隆、序列分析及原核表达鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因。根据GenBank已登录的IB-DV VP2基因序列,设计合成一对VP2基因特异性引物,应用RT-PCR技术从陕西省某鸡场分离的IBDV毒株中克隆VP2基因并进行序列分析。再将VP2基因亚克隆于原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-VP2,经鉴定正确后转化大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE检测。成功克隆IBDVYL毒株VP2全基因序列,核苷酸和氨基酸序列分析表明,YL株为IBDV超强毒株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,在宿主菌BL21中成功表达约为53 ku的VP2蛋白。IBDV VP2基因克隆表达成功,为IBDV的分子生物学特性研究提供资料,其表达产物为进一步制备抗IBDV单克隆抗体奠定了基础。
- 黄春旭许信刚童德文王志昇杜谦唐麒麟宁蓬勃
- 关键词：传染性法氏囊病病毒VP2基因基因克隆原核表达
