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嗜水气单胞菌主要粘附素基因序列及其重组基因表达产物功能分析: 为了深入探讨不同嗜水气单胞菌(Ah)之间主要粘附素基因在序列方面的差异以及主要粘附素的功能,了解主要粘附素在菌体侵入宿主和介导宿主产生免疫过程可能扮演的角色,对6株Ah菌主要粘附素基因进行克隆、测序,同时对Ah菌ZN1株...; 吴学敏; 关键词：嗜水气单胞菌生物学功能基因表达产物鱼类疾病; 文献传递

用RT-PCR方法检测猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染: ＜正＞猪瘟（CSFV）又称烂肠瘟,是由黄病毒科瘟病毒属成员之一的猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性传染病,被OIE列为A类传染病,给养猪业造成了重大的经济损失。目前,猪瘟在发病特点上,既有高病死率的急性、典型猪瘟,...; 王隆柏周伦江吴学敏俞玉鸿严山; 文献传递

猪细环病毒k2型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立被引量：2: 2016年; 为建立检测猪细环病毒k2型（Porcine Torque teno sus virus k2,PTTSu Vk2）SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,本研究根据PTTSu Vk2 ORF2基因序列特征设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PTTSu Vk2的实时荧光定量PCR方法,该方法在PTTSu Vk2 ORF2基因含量为1.92×102~1.92×107 copies/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物溶解曲线分析仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为（83.83±0.08）℃,对猪圆环病毒（Porcine circovirus type 1 and type 2,PCV1和PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪博卡病毒5型（Porcine bovavirus type 5,Pbo V5）、猪细环病毒1a型（PTTSu V 1a）和1b型（PTTSu V 1b）核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.39%~1.69%,组间变异系数0.69%~2.19%。本方法的建立可用于定量分析PTTSu Vk2感染噬性组织器官和感染程度,为PTTSu Vk2的流行病学研究及临床诊断等提供了一种可靠的方法。; 陈如敬黄秋宇修金生吴学敏严山车勇良周伦江; 关键词：ORF2基因 SYBR

应用双重PCR方法检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型: 本研究依据GenBank中公布的猪伪狂犬病毒和圆环病毒2型的基因序列,分别设计一对特异性引物,预计扩增长度分别为612bp和238bp.将PCR产物进行克隆测序,与PRV'Yangsan'株和PCV-2'JX0301'株...; 吴学敏陈如敬车勇良王隆柏刘玉涛严山周伦江; 关键词：猪圆环病毒病同源性分析; 文献传递

一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒: 本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒血清学鉴别诊断试剂盒。本发明建立的PRRSV血清学鉴别诊断试剂盒主要针对PRRSV类型有经典美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV和高致病性PRRSV进行血清学鉴别诊断。第1个ELISA板...; 陈如敬吴学敏周伦江陈秋勇车勇良严山王晨燕王隆柏魏宏刘玉涛; 文献传递

猪流行性腹泻病毒结构蛋白基因的遗传变异分析: 为探明2012-2014年福建省流行PEDV毒株结构蛋白基因的变异情况,本研究对19株PEDV的E基因和18株PEDV的M基因进行了克隆和序列分析。结果表明:与CV777标准毒株相比较,福建流行PEDV毒株的E和M基因存...; 王隆柏林裕胜王晨燕车勇良陈如敬吴学敏严山周伦江; 关键词：猪流行性腹泻病毒; 文献传递

PRRSV N与GP5蛋白抗原表位的串联表达及其间接ELISA检测方法的建立被引量：1: 2017年; 【目的】建立基于N与GP5蛋白抗原表位串联的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体ELISA检测方法,为开发准确、廉价的PRRSV抗体检测试剂盒奠定基础。【方法】将PRRSV的N蛋白和GP5蛋白抗原表位串联优化后进行原核表达,以表达的目的蛋白为抗原,通过优化反应条件建立检测PRRSV抗体的ELISA方法,对其特异性、重复性进行检测。用建立的间接ELISA方法和商品化IDEXX试剂盒同时对临床送检的45份猪血清样品进行检测,计算其符合率。【结果】SDS-PAGE和Western Blot分析表明,表达的目的蛋白分子质量约为24.7ku,具有良好的生物学活性,且为可溶性表达。目的蛋白经纯化后作为抗原包被ELISA平板,建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,优化后的ELISA条件为:抗原(纯化后的目的蛋白)包被量为5μg/mL、一抗(猪血清)1∶80稀释、酶标二抗1∶5 000稀释,以含50g/L脱脂奶粉的PBST作为封闭液,37℃孵育60min,抗体(一抗和酶标二抗)于37℃孵育90min,TMB避光显色8min;间接ELISA的判定标准为:OD450≥0.345 2为阳性,OD450<0.345 2为阴性。所建立的间接ELISA方法特异性强,对猪常见病原,如猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒高免血清检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为1.02%~3.94%和1.38%~4.83%。用所建立的间接ELISA方法对临床送检45份猪血清样品的检测阳性率为84.44%(38/45),商品化IDEXX试剂盒检测的阳性率为80%(36/45),2种方法的符合率为94.73%(36/38)。【结论】成功建立了基于N与GP5蛋白抗原表位串联的PRRSV抗体ELISA检测方法。; 陈如敬周伦江吴学敏车勇良王晨燕王隆柏黄晓凤严山刘玉涛魏宏; 关键词：N蛋白 GP5蛋白抗原表位间接ELISA

猪伪狂犬病毒荧光重组酶介导核酸扩增快速检测方法的建立与应用: 2024年; 【目的】基于荧光重组酶介导核酸扩增(Recombinase-aided amplification,RAA)技术,建立一种猪伪狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)快速检测方法。【方法】根据PRV gE基因序列,设计特异性引物及探针,优化扩增体系,建立PRV荧光重组酶介导核酸扩增检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,应用该方法对临床样品进行检测。【结果】该方法在43℃恒温反应23 min即可完成PRV核酸扩增,最低检出限为111 copies·μL^(-1);与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrheavirus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)、猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)均无交叉反应。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于5%;40份临床样品检测结果显示PRV阳性率为15%(6/40),检测结果与常规聚合酶链式反应(PCR)一致。【结论】成功建立了简便快速、高效准确的PRV实时荧光RAA检测方法,为PRV的快速检测和流行病学调查提供了新的检测手段。; 谢明杰康龙滨陈秋勇吴学敏王隆柏周伦江刘玉涛; 关键词：猪伪狂犬病毒

猪圆环病毒3型去核定位信号的Cap蛋白原核表达被引量：7: 2020年; 为探讨猪圆环病毒3型(PCV3)去核定位信号结构蛋白(Cap)的生物学功能及其在血清学检测中的作用,应用Oligo 7.0软件设计特异性引物序列,采用PCR方法从PCV3福建株阳性核酸中扩增获得其去核定位信号的Cap基因片段。将目的片段克隆到原核表达载体pET28a(+)上获得阳性重组表达质粒pET28a-Cap,进行原核表达条件优化。经SDS-PAGE分析其最优表达条件为IPTG浓度为0.4 mmol/L、37℃诱导表达4 h,目的蛋白大小约为25 ku。表达的去核定位信号Cap蛋白经Western blot和ELISA分析,具有良好的生物学活性。研究结果为开展PCV3去核定位信号基因功能研究和储备血清学诊断试剂盒奠定了基础。; 陈如敬吴学敏陈秋勇严山车勇良王晨燕周伦江; 关键词：结构蛋白原核表达

副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用被引量：12: 2013年; 【目的】建立一种可快速检测副猪嗜血杆菌的环介导等温扩增(LAMP)方法。【方法】根据GenBank中副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)基因序列,在其保守区域设计外引物、内引物和环引物用于LAMP检测。优化副猪嗜血杆菌LAMP检测的反应体系,在反应产物中加入SYBR GreenⅠ,对检测结果进行肉眼判定,建立副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,评价该检测方法的特异性、敏感性。用建立的副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法对临床分离的8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测。从疑似患副猪嗜血杆菌病的猪体内采集10种体液,用所建立的可视化LAMP检测方法进行检测。【结果】建立了副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法,该法在55℃水浴1h即可对副猪嗜血杆菌核酸进行高效扩增,反应结束后加入SYBR GreenⅠ即可通过肉眼观察对结果进行判断。该方法具有很强的特异性,其对DNA核酸的最低检测限为40fg,是常规PCR检测最低限的100倍,显示出较高的敏感性;用建立的LAMP方法对8株不同血清型副猪嗜血杆菌进行检测,结果均为阳性。用建立的LAMP方法对10种体液进行检测,结果鼻液、气管液、胸腔渗出物、心脏血、脑膜液、腹腔液和关节囊液呈阳性,唾液、心包液和尿液呈阴性。【结论】建立了一种可对副猪嗜血杆菌进行快速检测并可凭肉眼判定结果的可视化LAMP方法,该法操作简便、反应快速、敏感性强、特异性高,适合在兽医基层进行推广应用。; 车勇良陈如敬王隆柏江斌吴学敏刘玉涛严山庄向生周伦江; 关键词：副猪嗜血杆菌环介导等温扩增技术

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吴学敏

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