董濠鋆
- 作品数：2 被引量：5H指数：1
- 供职机构：暨南大学更多>>
- 发文基金：广州市科技计划项目广东省教育部产学研结合项目更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin的原核表达及其活性测定被引量：1
- 2013年
- 本文利用原核系统表达海蛇丝氨酸蛋白酶Harobin,并纯化和鉴定其活性。首先PCR法从模板分别扩增SUMO以及Harobin基因,再重叠PCR方法获得SUMO-Harobin融合基因,经NdeI、BamHI双酶切后,连入pET3C质粒,构建pET3C-SUMO/Harobin重组质粒。重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导菌体表达,收集菌体分析发现大部分目的蛋白为包涵体。将获得的包涵体经尿素变性,用Ni-NTA亲和层析后,梯度透析复性融合蛋白。复性好的蛋白用Benzamidin Sepharose亲和层析纯化,得到高纯度的融合蛋白。进一步采用降解纤维蛋白原法测定融合蛋白活性。结果成功构建了pET3C-SUMO/Harobin重组载体,融合蛋白Harobin在原核系统中是以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性复性,并结合两步纯化法获得了90%纯度的融合蛋白;经过测定纤维蛋白原降解能力,显示融合蛋白具有降解纤维蛋白原的活性。
- 董濠鋆张敏仪黎卓键吴国艺麦迪思沈巍徐明芳陈小佳
- 关键词：SUMO原核表达蛋白纯化
- 重组蛋白NtA-PACAP在大肠杆菌中的表达纯化及活性测定被引量：4
- 2013年
- 目的:通过构建PACAP38与Agrin的N端结构域(NtA)相连的重组基因的原核表达载体,获得重组NtA-PACAP蛋白,并验证其生物学活性,为未来的规模化制备奠定基础。方法:将PACAP38与层粘连蛋白的受体蛋白Agrin的N端通过连接肽相连,合成重组蛋白的基因片段,并在此基因片段末端连上6个组氨酸标签密码子,然后将此重组基因片段克隆至大肠杆菌表达载体pET-3c中,转化E.coli BL21(DE3),获得重组工程菌并摸索发酵和纯化条件,IPTG诱导表达后收集菌体破碎离心,收集上清液,经阴离子交换层析和Ni-NTA树脂亲和层析两步纯化法获得目的蛋白;通过PC12细胞饥饿损伤后修复实验模型来检测NtA-PACAP38的生物学活性。结果:成功表达并获得纯度90%以上的NtA-PACAP38蛋白,生物学活性实验证明NtA-PACAP38具有促饥饿损伤后的PC12细胞增殖能力。结论:获得的重组蛋白NtA-PACAP38具有生物学活性,表达系统和纯化工艺可以用于下一步的规模化制备。
- 王晶吴陆生陈小佳董濠鋆沈巍张敏仪洪岸
- 关键词：PACAP重组蛋白蛋白纯化
