尹岚岚
- 作品数：4 被引量：0H指数：0
- 供职机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- EIAV基因转移载体包装盒表达质粒的构建
- 2009年
- 在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体成功构建并优化的基础上,构建了EIAV基因转移载体包装盒表达重组质粒。分别根据EIAV驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆(pLGFD3-8)和驴白细胞弱毒疫苗株感染性分子克隆pOK8266T序列,设计并合成引物,扩增EIAVgag/pol全基因和rev基因的第2个外显子,分别插入真核表达载体pCDNA3.1(+),获得表达载体pCDFGP和pCDREV,与亲本株的核苷酸同源性分别是99.6%和99.8%,编码蛋白Gag、Pol及Rev蛋白的推测氨基酸同源性分别为99.2%、98.3%和100%。利用脂质体法,分别将pCDFGP和pCDREV单独及共转染HEK293细胞,利用EIAV阳性血清分别进行间接免疫荧光抗体试验(IFA)和蛋白免疫印迹试验(westernblot),检测外源蛋白的表达情况。结果表明,双质粒共转染的细胞中转染后48h可检测到特异性荧光,转染后60h的细胞裂解产物中可以检测到55ku的Gag蛋白及26ku的p26蛋白,而单独转染pCDFGP和pCDREV的细胞,IFA和western blot试验结果均为阴性。结果表明同时存在gag/pol和rev基因第4外显子的情况下,EIAV包装盒才能表达。
- 韩凌霞尹岚岚李亚明牛成明高鹏飞曲连东
- 关键词：马传染性贫血病毒
- EIAV基因转移载体的优化
- 2008年
- 本研究在马传染性贫血病毒(EIAV)基因转移载体pcPPTPRE(+)的基础上[含有报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)和人乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)],对其转录后调控元件和外源基因启动子进行优化。参考土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)基因组序列和人巨细胞病毒增强子/鸡β-actin启动子序列(CAGp),设计合成2对引物,分别扩增WHV转录后调控元件(WPRE)和CAGp片段,正向插入pcPPTPRE(+)获得重组质粒pcPPTWPRE和pcPPTWCAG。将获得的EIAV转移载体pcPPTWPRE和pcPPTWCAG以及pcPPTPRE(+),脂质体法分别转染人胚肾细胞HEK293和鸡胚成纤维细胞系DF-1,转染后12 h、24 h、36 h、48 h在荧光显微镜下观察特异性绿色荧光的表达。48 h后收获细胞,利用流式细胞仪检测转染细胞中表达EGFP的阳性细胞。结果表明,在HEK293细胞中pcPPTWPRE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均极显著高于pcPPTPRE(+)(P<0.01),pcPPTWCAG显著高于pcPPTWPRE(P<0.05);pcPPTWCAG的平均道数值极显著高于pcPPTPRE(+)和pcPPTWPRE,pcPPTWPRE显著高于pcPPTPRE(+)。在DF-1细胞中pcPPTWPRE和pcPPTWCAG的阳性细胞平均百分率均显著高于pcPPTPRE(+),而pcPPTWPRE和pcPPTWCAG的平均道数值均极显著高于pcPPTPRE(+),pcPPTWCAG显著高于pcPPTWPRE。本研究利用WPRE和CAGp优化构建了EIAV基因转移载体pcPPTWCAG,获得了较强的基因表达能力,为以鸡为宿主进行转基因研究提供了条件。
- 尹岚岚韩凌霞李亚明司昌德于海波徐佳曲连东冉多良
- 关键词：马传染性贫血病毒基因转移载体绿色荧光蛋白
- 鸡β-肌动蛋白第一内含子对EIAV载体质粒外源蛋白表达能力的影响
- 2007年
- 以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)基因转移载体pcPPTW PRE为基础,用含不同长度片段的鸡β-肌动蛋白启动子替换原有的人巨细胞病毒立即早期启动子(CMVIEp)启动外源基因的表达,分别构建了2个基因转移载体,含部分第一内含子的pWCAGP0.8和含全长内含子的pWCAGP1.6。连同已构建的不含内含子的质粒pcPPTWCAG,采用磷酸钙法分别转染HEK293细胞和DF-1细胞,利用荧光显微镜观察报告基因eGFP蛋白的表达。并利用流式细胞仪定量。统计学分析结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8和pWCAGP1.6表达阳性率分别为47.9%、46.1%和23.8%,转染后48h,收获细胞,利用流式细胞仪比较转染细胞中EGFP表达阳性细胞的百分率。结果表明,在HEK293细胞中,pcPPTWCAG、pWCAGP0.8和pWCAGP1.6的阳性细胞分别占计数细胞的47.9%、46.1%和23.8%;在DF-1细胞中,依次分别为12.4%、9.5%和4.2%,pcPPTWCAG与pWCAGP1.6差异显著。表明不含内含子的EIAV载体质粒表达EGFP的能力高于含部分和全长内含子的载体。
- 韩凌霞李亚明尹岚岚司昌德于海波曲连东
- 关键词：马传染性贫血病毒基因转移载体
- 伪型EIAV病毒的制备
- 马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)是一种非灵长类慢病毒，而且是基因组结构最简单的慢病毒，可以将前病毒基因组持久地整合到感染细胞的染色体上并在感染细胞和子代细胞中表达...
- 尹岚岚
- 关键词：贫血病毒病毒基因组染色体病毒基因
- 文献传递
