程晓东
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 供职机构：南京医科大学基础医学院微生物学系与免疫学系更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 卡波氏肉瘤病毒K1蛋白在血管内皮细胞中的表达及其功能初探
- 2013年
- 目的:获得稳定表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K1蛋白的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),探究K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。方法:从本实验室已构建好的含KSHV K1基因的重组真核表达质粒pCI-neo-K1中扩增出K1基因,克隆入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZs-Green中构建重组质粒pHAGE-K1。利用脂质体将pHAGE-K1与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,收集培养上清经0.45μm滤膜过滤即获得慢病毒悬液。病毒感染HUVECs,Western blot检测K1蛋白的表达。通过绿色荧光蛋白进行流式分选、Western blot验证获得稳定表达K1蛋白的HUVECs。通过细胞增殖实验和细胞划痕实验检测K1蛋白对HUVECs增殖和迁移能力的影响。结果:核酸序列测定证实,克隆的K1基因全长906 bp,与GenBank中登记的K1基因100%同源。Western blot结果显示,含K1基因的重组慢病毒感染的HUVECs在约46 000处可观察到一特异性条带,与预期的K1蛋白大小一致。流式分选获得稳定表达K1蛋白的HUVECs,其增殖能力与对照组相比显著增强(P<0.01),细胞迁移能力亦明显增加(P<0.05)。结论:成功包装了含KSHV K1基因的重组慢病毒。KSHV K1蛋白能够促进HUVECs增殖和迁移。
- 程晓东薛敏郝婷婷秦娣卢春
- 关键词：增殖
- HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定被引量：2
- 2013年
- 目的:在大肠埃希菌中表达人免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)反式激活蛋白(trans activative transcription protein,Tat),为进一步研究可溶性Tat在艾滋病相关卡波氏肉瘤(AIDS-KS)致病过程中的作用提供材料。方法:以本实验室保存的重组质粒pcDNA3.1(+)/Tat101为模板,PCR扩增目的基因Tat。将PCR产物克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-Tat。将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定后,通过镍亲和层析柱纯化。纯化后蛋白采用虫荧光素酶报告实验进行功能验证。结果:限制性内切酶酶切和基因测序证实,成功构建了含有Tat基因的重组原核表达质粒。蛋白质印迹结果显示,His融合蛋白在大肠埃希菌中得到正确表达,纯化后获得了相对分子质量为18×103的融合蛋白。虫荧光素酶报告实验证实,Tat与HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)具有结合能力。结论:重组质粒pET-28a(+)-Tat能在大肠埃希菌BL21(DE3)中稳定表达Tat蛋白,镍亲和层析柱纯化的His-Tat融合蛋白具有生物学功能。
- 邱会平程晓东卢春
- 关键词：TAT基因人免疫缺陷病毒
