张书敏
- 作品数：3 被引量：19H指数：2
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- 大鼠胱抑素C腺病毒高效表达载体的构建在大鼠心肌成纤维细胞中的表达被引量：2
- 2011年
- 目的采用Gateway^(TM)技术构建携带胱抑素C(CysC)基因的重组腺病毒载体,并观察在大鼠心肌成纤维细胞中的表达。方法采用RT-PCR方法从大鼠心肌组织中扩增出CysC基因,将CysC基因经BP重组反应定向克隆至pDONR221载体,获得重组质粒pDONR221-CysC,经PCR及测序验证正确的pDONR221-CysC与腺病毒载体pAd/CMV/V_5-DEST在体外进行LR重组反应,CysC取代pAd/CMV/V_5-DEST中的ccdB-Cm^R基因,获得重组腺病毒载体pAd/CMV/V_5-DEST-CysC。采用Western blot技术检测CysC蛋白在293A细胞及大鼠心肌成纤维细胞中的表达。将培养的心肌成纤维细胞随机分为实验组、空载体组和对照组。结果 CysC腺病毒高效表达载体构建成功,测得病毒滴度为5.36×10^(10)ifu/ml,用重组CysC腺病毒转染心肌成纤维细胞24 h后,实验组的转染效率最高(≥90%);与对照组和空载体组比较,实验组CysC蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论成功构建了大鼠CysC腺病毒高效表达载体,并成功包装了含有该基因的重组腺病毒,可有效转染心肌成纤维细胞。
- 张书敏王永梅杜贻萌魏峰涛蒋卫东王欣董兆强姜红鹿庆华
- 关键词：腺病毒科半胱氨酸蛋白酶抑制剂逆转录聚合酶链反应
- 胱抑素C对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响被引量：5
- 2010年
- 目的探讨胱抑素C（CysC）高表达对大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖能力的影响。方法取出生1~3d的Sperague-Dawley（SD）清洁级大鼠10只,体质量10~15g,差速贴壁法培养乳鼠心肌成纤维细胞;采用Gateway技术构建重组CysC腺病毒高效表达载体（Ad-CysC）并体外转染大鼠CFs;将对数生长期的大鼠CFs随机分成正常细胞组（PBS组）,携有绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒组（Ad-GFP组）及CysC腺病毒高表达组（Ad-CysC组）。采用蛋白免疫印迹技术（WB）检测CysC蛋白在CFs中的表达情况,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入法检测CysC高表达对CFs增殖能力的影响。结果经DNA测序及WB结果分析,CysC腺病毒高效表达载体构建成功,转染CFs24h后（MOI=200）,Ad-CysC的转染效率高达90%以上;用重组CysC腺病毒转染CFs后,CysC蛋白在24h即有明显的表达上调（P〈0.05）;与PBS组及Ad-GFP组相比,转染Ad-CysC的CFs在72h的BrdU摄取率显著提高（P〈0.05）。结论大鼠CysC腺病毒高效表达能够促进CFs增殖,可能加速心肌纤维化进程。
- 张书敏王永梅杜贻萌魏峰涛蒋卫东王欣董兆强徐冬玲姜红鹿庆华
- 关键词：胱抑素C心肌成纤维细胞细胞增殖
- 组织蛋白酶S、K和胱抑素C在压力负荷性心肌肥厚大鼠左心室重构中的表达被引量：12
- 2010年
- 目的探讨组织蛋白酶S(CatS)、组织蛋白酶K(CatK)和胱抑素C在压力负荷性心肌肥厚左心室重构过程中的表达及其相互关系。方法雄性Wistar大鼠60只被随机分配到4周假手术组(F4)、8周假手术组(F8)、4周手术组(T4)以及8周手术组(T8)。采用腹主动脉缩窄法构建心肌肥厚模型和心力衰竭模型。用实时荧光定量PCR和免疫组化法分别检测CatS、CatK和胱抑素CmRNA及蛋白表达,用Masson染色法分析左心室肌间质和血管周围纤维化程度,心脏超声和血流动力学测定心功能和心室重构。结果实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)结果显示T4组大鼠心肌中的CatS、CatK及胱抑素CmRNA的表达均明显高于F4组大鼠(均P<0.05)。T8组大鼠心肌中的CatS、CatKmRNA的表达进一步升高,显著高于F8组(P<0.01),而T8组大鼠心肌中的胱抑素CmRNA的表达则降至正常水平。增高的CatS、CatK及胱抑素C蛋白主要表达于心肌细胞。结论 CatS、CatK和胱抑素C参与了压力负荷性心肌肥厚左心室的重构。
- 陈琳鹿庆华王光允张书敏杜贻萌魏峰涛王永梅王荣
- 关键词：心室重构组织蛋白酶半胱氨酸蛋白酶
