张玉龙
- 作品数：3 被引量：11H指数：2
- 供职机构：东北林业大学林学院更多>>
- 发文基金：黑龙江省自然科学基金中国博士后科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学更多>>
- 偏肿革裥菌锰过氧化物酶酶学性质和染料脱色被引量：3
- 2017年
- 【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)所产锰过氧化物酶(MnP)纯酶的序列特征、酶学性质及其对染料的脱色能力,为其应用于木质素降解、染料脱色奠定基础。【方法】将纯化后的样品经SDS-PAGE检测后获得的唯一L.gibbosa MnP条带切割,采用Nano液相色谱-电喷雾串联质谱法联用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽测序技术对蛋白氨基酸序列进行测定。利用该SDS-PAGE图谱,建立蛋白分子量与迁移率的标准直线,从标准直线上求出MnP纯酶样品的表观分子量;参照酶活测定方法检测最适反应温度及温度稳定性、最适反应p H值及p H稳定性;采用lineweaver-Burk双倒数作图法求解米氏动力学常数Km值。研究L.gibbosa菌种培养液和MnP纯酶液对蒽醌类的茜素红、偶氮类的刚果红、杂环类的中性红和三苯基甲烷类的结晶紫等4种不同类型染料的脱色能力。【结果】串联质谱扫描出2条MnP的保守序列肽段,与克隆到的基因Lg-mnp1编码的Lg-MnP1(Gen Bank登录号:ACO92620)序列完全吻合,表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一电泳带中主要的蛋白。Lg-MnP1的表观分子量为45.39 k Da,最适反应温度为35℃,在低于40℃的条件下都具有一定的催化能力,但温度超过50℃后迅速失活;其最适反应pH值为3.5,p H超过4.5反应程度就迅速下降,在p H为2~3时最稳定;在以2,6-DMP为底物时,在21℃条件下其米氏常数Km为6.124 mmol·L^(-1)。L.gibbosa培养液对染料在1 h的脱色率分别为茜素红100%、中性红22.17%、刚果红19.09%,对结晶紫的脱色率很低,在36 h脱色率仅为0.018%。纯化后的Lg-MnP1溶液对染料的最大脱色率在2 h分别为中性红100%、刚果红95.55%、茜素红75.85%和结晶紫36.57%。【结论】SDS-PAGE得到的唯一一条电泳带中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一种中温性、偏酸性的酶,与2,6-DMP的亲和力较大。L.gibbosa含有菌丝的培养液对茜素红具有彻底的降解效果,但Lg-MnP1纯酶�
- 张玉龙池玉杰冯连荣
- 关键词：锰过氧化物酶纯化酶学性质染料脱色
- 偏肿革裥菌锰过氧化物酶的分级纯化被引量：1
- 2017年
- 【目的】研究白腐菌偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶(MnP)的分级纯化,以期得到L.gibbosa MnP的纯品和进行后续酶学性质研究。【方法】在对L.gibbosa所产MnPs进行优化培养、获得大量MnPs粗酶液的基础上,通过硫酸铵(NH4)2SO4分级盐析、聚乙二醇(PEG)沉淀进行粗酶液浓缩、在起始缓冲液中进行透析、经DEAE-琼脂糖CL-6B离子交换柱层析进行梯度洗脱和葡聚糖G-75凝胶过滤柱层析等方法对MnPs粗酶液进行纯化,并对分级纯化方法进行优化,对纯化浓缩后的纯酶样品采用SDS-PAGE方法进行酶纯度检验。【结果】在75%、80%和85%这3种(NH_4)_2SO_4饱和度中,85%的(NH_4)_2SO_4是沉淀MnPs的适宜饱和度,在该饱和度下测得上清液中酶活为3.63 U·L^(-1),蛋白浓度为0.132 mg·mL^(-1),表明MnPs已基本沉淀完全;试管小试法确定离子交换柱层析中上样的最适缓冲体系为pH7的Na_2HPO_4-NaH_2PO_4起始缓冲液;离子交换柱层析后收集的洗脱液检测到3个蛋白吸收峰,其中只在第2个蛋白吸收峰中检测出MnP活性,该MnP活性值变化曲线与蛋白吸光值一致。这个活性峰经凝胶过滤柱层析后,洗脱结果只出现1个明显的蛋白吸收峰,在其中检测出较高的MnP活性;浓缩后的冻干样品经SDS-PAGE电泳检测只在约40 k Da处有1条清晰的蛋白谱带,表明对MnP的纯化已达到电泳纯。【结论】筛选出85%饱和度的(NH_4)2_SO_4盐析法是初期沉淀与纯化L.gibbosa所产MnPs的最适方法;PEG浓缩法简便、易行、有效;初期浓缩后再经过离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析可以得到电泳纯的MnP纯化样品。
- 张玉龙池玉杰冯连荣
- 关键词：锰过氧化物酶纯化
- 偏肿栓菌产锰过氧化物酶条件优化被引量：9
- 2011年
- 采用LNAS(低氮天冬酰胺-琥珀酸)培养基用4种不同的底物处理方式,对白腐菌偏肿栓菌在28℃下进行静止培养,得到不同时间内的培养液,用紫外可见分光光度计分别检测在470,420,310nm处对于2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)、2,2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、藜芦醇(VA)的氧化作用后光密度值的变化情况,作为其木质素降解酶系统锰过氧化物酶(MnP)、漆酶和木质素过氧化物酶(LiP)产生的依据。结果表明:偏肿栓菌可产生MnP(必须在Mn2+存在的条件下)和漆酶(不依赖于Mn2+),但不产生LiP;在培养液内添加底物木屑和2,6-DMP后可显著提高2种酶的分泌量。在此基础上,用含Mn2+和青杨木屑的LNAS培养基对偏肿栓菌在30℃下静止培养作为初始培养条件,然后采用2次正交试验和多种单因素试验对偏肿栓菌产MnP的培养基组分和培养条件进行优化。结果表明:在试验设定的因素和水平范围内的最优组合是培养液果糖浓度为5g.L-1、酒石酸铵浓度为15mmol.L-1、锰离子浓度是200μmol.L-1、吐温-80浓度为0.25mL.L-1,MgSO4.7H2O浓度为0.35g.L-1、矿质元素溶液和维生素溶液加入量分别为10和1mL.L-1;培养液pH值4.5;培养温度27℃;150r.min-1摇瓶培养条件下装液量为110mL。酶活可达314.52U.L-1,比优化前提高8.4倍。
- 张玉龙池玉杰闫洪波
- 关键词：木质素降解酶锰过氧化物酶正交试验
