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李家大: 作品数：34 被引量：59H指数：5; 供职机构：中南大学更多>>; 发文基金：国家自然科学基金新疆维吾尔自治区自然科学基金河南省基础与前沿技术研究计划项目更多>>; 相关领域：医药卫生生物学文化科学农业科学更多>>

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Waardenburg综合征致病基因SOX10重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义被引量：4: 2015年; 目的通过构建基因SOX10及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达，为研究Waardenburg综合征（Waardenburgsyndrome，WS）发病机制提供实验基础。方法通过分子克隆技术双酶切pECE-SOX10和pCMV—Flag后连接构建SOX10基因重组真核细胞表达质粒pCMV-SOX10-Flag，以其为模板分别构建SOX10基因新发突变G37fs、G38fs和E248fs表达质粒，DNA测序鉴定。SOX10、G37fs、G38fs和E248fs表达质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞，Western印迹和细胞免疫荧光分别检测和观察野生和突变SOX10蛋白在NIH3T3细胞中的外源性表达和定位表达。结果SOX10及其突变体G37fs、G38fs和E248fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确，三者在NIH3T3细胞中正确表达，E248fs与SOX10仅在细胞核中分布，G37fs和G38fs在细胞质与细胞核中均有分布。结论成功构建了SOX10基因及其突变体真核细胞表达质粒，突变对SOX10蛋白的亚细胞定位产生影响，为在体外实验进一步研究中国人SOX10基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。; 张华冯娟陈红胜李家大罗浑金冯永; 关键词：基因突变体外实验

低促性腺激素性性腺功能减退症患者PROKR2基因突变分析被引量：1: 2022年; 为探讨特发性低促性腺激素性性腺功能减退症(IHH)患者的临床及遗传学特征, 回顾性分析23例IHH患者的临床资料, 应用全外显子测序(WES)结合Sanger方法进行基因分析, SIFT和Polyphen 2种生物信息学平台对突变位点进行功能预测。结果显示, 在23例IHH患者中, 9例患者存在前激动素2(PROKR2)基因突变, 其中4种错义突变(p.W178S、p.Y113H、p.A103V、p.R164Q), 1种移码突变(p.D42delinsDED), 功能预测显示以上突变可能是该病的致病基因, 余14例阴性。IHH患者无论PROKR2基因突变有无, 其卵泡刺激素、黄体生成素、睾酮、雌二醇水平差异均无统计学意义。PROKR2基因突变与IHH疾病可能相关, 其突变丰富基因致病谱。; 解一丹郑瑞芝韩宾宾袁慧娟李家大; 关键词：性腺功能减退症突变

利用酵母双杂交技术筛选人PROKR2蛋白C端相互作用蛋白被引量：1: 2018年; 目的:利用酵母双杂交技术从人c DNA文库中筛选人前动力蛋白受体2(hPROKR2)C端相互作用蛋白。方法:复苏酵母菌Y2HGold-hPROKR2-C,与人c DNA文库杂交,计算杂交效率;筛选相互作用克隆并测序,寻找hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白;通过在DDO/X、QDO/A/X平皿上划线,对筛选到的人c DNA文库质粒的自活性进行验证;采用GST pull down进一步验证两者之间的相互作用。结果:酵母双杂交实验的杂交融合效率为1.375×10~8;在人cDNA文库中筛选出hPROKR2蛋白C端相互作用蛋白SNAPIN,GST pull down实验证实两者之间存在相互作用。结论:SNAPIN可与hPROKR2蛋白C端结合。; 周晓涛周文涛夏开德刘化蝶彭震赵云娟迪丽娜尔.波拉提李家大; 关键词：相互作用蛋白酵母双杂交

酵母表达质粒pGBKT7-hPROKR2-Ct的构建及hPROKR2C端蛋白的自激活鉴定: 2016年; 目的:检测Y2HGold酵母株中表达的h PROKR2 C端蛋白是否有毒性及自激活,为后期利用酵母双杂交技术研究h PROKR2 C端相互作用蛋白奠定基础。方法:构建酵母双杂交载体p GBKT7-h PROKR2-Ct质粒,将其转入酵母感受态中验证其是否表达并计算转化率;通过观察SD/-Trp平板上酵母菌落生长状态进行h PROKR2 C端蛋白的毒性检测;通过观察SD/-Trp、SDO/-Trp/X、SDO/-Trp/X/Aba平板上酵母菌落生长状态进行h PROKR2 C端蛋白自活性检测。结果:构建了酵母双杂交载体p GBKT7-h PROKR2-Ct,将其转入酵母感受态中,转化率为8.5×104cfu/μg;毒性及自活性检测均显示h PROKR2 C端蛋白对酵母菌株无毒性、不具有自活性。结论:可以利用酵母双杂交系统研究hPROKR2 C端相互作用蛋白。; 周晓涛夏开德周文涛刘化蝶彭震汤勇李家大; 关键词：酵母双杂交

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达被引量：1: 2000年; 将拟南芥 ATL P- 3基因从质粒 p UCTL 亚克隆到植物表达载体 p BI12 1中 ,得到的质粒命名为p BITL。被亚克隆到重组质粒 p BITL 的 ATL P- 3基因通过农杆菌 L BA44 0 4介导法导入烟草 (N icotiana tobacco L.var Gexin No.1)。通过卡那霉素抗性筛选 ,得到 19株再生烟草植株。PCR(用根据 ATL P- 3基因合成的引物 )检测到其中 4株 (A1、A4、B2、C6 )有 ATL P- 3基因的整合。进一步的 PCR(用根据 Ca MV35 s启动子和 NOS终止子序列合成的引物 )分析表明 ,ATL P- 3基因是在 Ca MV35 s启动子和 NOS终止子控制下整合到烟草的基因组 DNA中的。 4株转基因烟草的 Southern blotting检测结果显示 ,只有被整合到 B2和 C6的 ATL P- 3基因稳定地存在于基因组 DNA中 ;Western blotting检测分析表明 ,仅有 C6转基因植株表达了 ATL P-; 黄虎耿川东李家大郝建疆谢伟军龚蓁蓁; 关键词：转基因烟草

拟糖多肽及其应用被引量：6: 2000年; 李家大王克夷; 关键词：噬菌体展示疫苗

中国先天性低促性腺激素性性腺功能减退症患者ANOS1的突变被引量：1: 2022年; 目的:先天性低促性腺激素性性腺功能减退症(congenital hypogonadotropic hypogonadism,CHH)是一种罕见的先天性疾病,由于下丘脑促性腺激素释放激素的合成、分泌或信号转导缺陷引起先天性性腺发育不良。CHH以青春期发育延迟或缺乏、性激素及促性腺激素水平低下为主要表现,同时可能伴有其他临床表型。一部分CHH患者伴有嗅觉丧失或低下,被称为卡尔曼综合征(Kallmann syndrome,KS)。ANOS1基因是第一个被发现的CHH致病基因,位于X染色体上,其突变可导致X-连锁隐性遗传的CHH。本研究拟通过分析CHH患者中ANOS1的基因突变图谱以及临床表型和基因型的关系,为CHH的遗传学诊断奠定基础。方法:利用全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)的方法筛选来自中国的165名男性CHH患者中ANOS1基因的罕见变异(rare sequencing variants,RSVs)。利用Polyphen2、Mutation tastaster、SIFT和CADD(Combined Annotation Dependent Depletion)4种常见的生物信息学工具预测编码区变异的功能,基于神经网络的剪接位点预测(Splice Site Prediction by Neural Network,NNSPLICE)软件对检测到的内含子区的RSVs进行注释,并利用美国医学遗传学和基因组学学院(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)遗传变异分类标准与指南判断ANOS1 RSVs是否具有致病性。初步建立中国人群CHH患者ANOS1的遗传突变谱,通过收集部分患者详细的临床资料,建立临床表型和基因型的相关性。结果:WES分析显示165名CHH患者中17例患者发生了ANOS1突变,突变频率为10.3%。在17名CHH患者中共检测到13个ANOS1 RSVs,包括5个无义突变(p.T76X、p.R191X、p.W257X、p.R262X和p.W589X),2个剪切位点突变(c.318+3A>C和c.1063-1G>C)和6个错义突变(p.N402S、p.N155D、p.P504L、p.C157R、p.Q635P及p.V560I)。在17名携带ANOS1 RSVs的患者中,很多同时伴有其他临床表型,其中最常见的为隐睾(10/17),其次是单侧肾脏发育不全(3/17),牙齿�; 曾旺李家大李家大姜芳门美超; 关键词：隐睾

研究生“医学科研设计”慕课建设与应用探讨被引量：2: 2022年; “医学科研设计”作为方法类课程是医学研究生重要的专业基础课。文章在简述医学科研设计教学目标的基础上,围绕医学科研设计慕课教学团队的建设、教学短视频资源和非视频资源建设、教学活动的组织与成绩评定分享“医学科研设计”的课程建设经验,并进一步结合“医学科研设计”慕课的应用从有利于满足不同学习者个性化学习需求、有利于促进研究生教育的课堂教学改革及有利于构建“互联网+”课程思政模式提出思考和建议。; 罗自强冯丹丹秦晓群黄菊芳胡长平李家大熊鲲何海伦黎明李芳曾小敏史静琤程岩; 关键词：研究生教育医学科研设计

应用CRISPR-cas9技术敲除PAH基因建立小鼠自闭症模型: 目的：利用CRISPR-cas9 技术敲除小鼠PAH 基因,建立小鼠自闭症的动物模型。方法：设计PAH 基因的sgRNA,构建PUC57-sgRNA 载体,在体外将sgRNA 以及Cas9 的载体转录为RNA,通过显微注...; 曹贝贝李登峰黄婷李家大; 关键词：PAH基因自闭症

MITF基因突变致Ⅱ型Waardenburg综合征发病的实验研究被引量：1: 2014年; 目的通过体外实验研究小眼球畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)突变基因功能,初步探讨其致Ⅱ型Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome,WS)发病的分子机制。方法以野生型MITF基因真核细胞表达质粒pCMV-MITF-Flag为模板分别构建二个致Ⅱ型WS的MITF基因新发突变R217I和T192fsX18的真核细胞表达质粒。野生MITF和突变R217I和T192fsX18表达质粒瞬时转染黑色素瘤细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞),应用Western blot和细胞免疫荧光分别检测其表达和亚细胞定位;应用荧光素酶活性检测系统通过对酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)报告基因活性检测观察野生/突变MITF蛋白对其靶基因TYR转录活性的调控作用,以及二个突变蛋白对野生MITF蛋白功能的影响;应用生物素标记的含E box基序(CATGTG)的DNA寡核苷酸链探针分别沉淀MITF、R217I及T192fsX18蛋白,检测野生/突变MITF蛋白与靶基因TYR启动子的结合力。结果成功构建了突变型R217I、T192fsX18真核细胞重组表达质粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fsX18-Flag,MITF蛋白与R217I、T192fsX18突变蛋白在黑色素瘤细胞中正确表达,进一步验证了重组质粒构建的正确性。突变R217I蛋白与野生MITF蛋白一样仅在细胞核中分布,而T192fsX18蛋白则出现异常亚细胞定位,仅在细胞质中分布。尽管R217I蛋白仍残余部分功能可增加TYR启动子转录活性,但与野生MITF蛋白相比,二者差异有显著统计学意义(P<0.01),而T192fsX18蛋白则完全失去调控TYR启动子转录活性作用(P<0.01);二者均未对野生MITF蛋白功能产生显性负效应(P>0.05)。突变R217I蛋白与野生MITF蛋白均可与TYR启动子特异DNA序列E-box结合,而突变T192fs X18蛋白则不能与之结合。结论 R217I和T192fsX18突变蛋白通过影响靶基因TYR转录活性,使其表达下调、黑色素合成减少,以单倍体剂量不足效应致Ⅱ型WS。; 张华陈红胜李家大罗洪金梅凌云贺楚峰冯永; 关键词：WAARDENBURG综合征基因突变体外实验

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