王霞
- 作品数：9 被引量：11H指数：2
- 供职机构：复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验
- 2004年
- 目的 表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力。方法 用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20—lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体。将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)_(600nm)达到0.6时,加入终浓度为1mmol/L IPTG诱导目的蛋白的表达。表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力。结果 IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20％以上。表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85％以上目的蛋白。凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变。结论 融合蛋白HA20—lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率。
- 孙兴会张宇清王霞侯敏谭理李平朱运松
- 关键词：大肠埃希菌融合基因基因表达
- ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定被引量：4
- 2004年
- 为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .
- 王霞侯敏孙兴会张宇清李平谭理朱运松
- 关键词：融合蛋白基因毕赤酵母克隆尿激酶型纤溶酶原激活物
- Lys_(10)-PAI-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和凝胶阻滞实验被引量：5
- 2003年
- 用PCR方法构建 10个赖氨酸与纤溶酶原激活剂抑制物 1的融合基因Lys10 PAI 1,并克隆于pET2 8a(+ )和pET32a(+ )原核表达载体 .将重组表达质粒pET32 PAI和pET2 8 PAI转化大肠杆菌BL2 1(DE3) .IPTG诱导后可获得分子量分别为 6 3kD和 4 3kD的目的蛋白 ,表达蛋白占菌体蛋白2 0 %以上 ,大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物经变性、复性、超滤、透析和亲和层析等步骤 ,可以得到纯化的Trx·PAI 1和rPAI 1重组蛋白 .Western印迹结果表明 ,目的蛋白具有人PAI 1的抗原性 .凝胶阻滞实验发现 ,纯化的重组蛋白在一定条件下 ,可以与质粒结合 ,使质粒的迁移率明显改变 .研究结果表明 ,Trx·PAI 1和rPAI
- 孙兴会李平张宇清谭理王霞侯敏陈怡韵朱运松
- 关键词：纤溶酶原激活剂抑制物-1融合基因纯化
- PAI-2在细胞内的定位影响其抗凋亡的活性
- 2003年
- 目的 为了进一步了解纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在细胞内的定位对其抗凋亡活性的影响。方法 构建绿色荧光蛋白质(EGFP)与PAI-2入核突变体融合蛋白质的表达质粒;转染HeLa细胞,荧光显微镜下比较野生型PAI-2与PAI-2的入核突变体在HeLa细胞内分布的差异;用MTT法检测PAI-2入核突变体抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导细胞凋亡的活性。结果 在核定位序列的引导下,几乎所有的PAI-2都进入了细胞核,而野生型PAI-2则弥散分布于HeLa细胞内。MTT法检测发现,当PAI-2被定位于细胞核内时,丧失其抗凋亡的功能。结论 PAI-2在细胞内的定位能影响其抗凋亡的活性,并且当用TNF-α诱导HeLa细胞凋亡时,野生型PAI-2在细胞内的分布没有发生明显的改变。
- 张宇清侯敏王霞孙兴会李平朱运松
- 关键词：PAI-2肿瘤坏死因子-Α细胞凋亡
- PAI-2的两个突变体对TNF-α诱导细胞凋亡的抗性
- 2003年
- 目的 研究纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)的两种不同突变体抵抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导Hela细胞凋亡的活性差异,探讨PAI-2CD螺旋间区的空间构象对其抗凋亡功能的影响。方法 分别构建突变体PAI-2D和PAI-2M真核表达质粒。转染Hela细胞,RT-PCR鉴定,筛选出能稳定表达PAI-2D和PAI-2M的阳性细胞株。用MTT法检测PAI-2的这两个突变体抗凋亡的活性,并利用计算机同源模建,比较PAI-2的这两个突变体空间构象的变化。结果 突变体PAI-2M能抑制TNF-α诱导的Hela细胞凋亡,而PAI-2D则不能。PAI-2M较好地保持了野生型PAI-2的空间构象,而PAI-2D CD螺旋间区的空间构象则发生了较大的变化。结论 PAI-2抑制TNF-α诱导的细胞凋亡依赖于其CD螺旋间区空间构象的完整性,而与PENF结构域(PENF73～76)无关。
- 张宇清侯敏王霞孙兴会李平朱运松
- 关键词：PAI-2突变体TNF-Α肿瘤坏死因子-Α细胞凋亡
- 腺病毒介导的uPAR反义核酸转移抑制肿瘤细胞的侵袭
- 2003年
- 为了观察尿激酶受体(uPAR)反义核酸对肿瘤细胞体外侵袭的抑制作用,用PCR方法扩增uPARcDNA 5′端 -4 6bp～ +45 4bp一段长 5 0 0bp的序列,利用DNA重组技术将其克隆到病毒载体pAdeno X中,构建出重组腺病毒载体pAdeno X uPAR( - )和pAdeno X uPAR( +).线性化后的重组腺病毒载体转染HEK2 93细胞 7天后,可以获得滴度分别为 1 5× 10 8pfu/ml和 0 5× 10 8pfu/ml的uPAR反义和正义核酸表达重组腺病毒,分别命名为Ad uPAR( -)和Ad uPAR( +).以不同的病毒感染指数(MOI)感染人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞,3天后用RNA印迹法可以检测肿瘤细胞uPAR正义和反义核酸表达水平,随着MOI的升高,Ad uPAR( - )感染的肿瘤细胞uPAR蛋白水平逐渐下降,肿瘤细胞的体外侵袭能力也明显下降,而感染Ad uPAR( +)的肿瘤细胞无明显变化.结果表明,重组腺病毒可以表达uPAR正义和反义核酸,uPAR反义核酸可以明显抑制人肺巨细胞癌高转移株 95D肿瘤细胞在体外的侵袭能力.
- 孙兴会谭理李平张宇清王霞侯敏宋后燕朱运松
- 关键词：腺病毒介导反义核酸肿瘤细胞腺病毒尿激酶受体
