陈慧卿
- 作品数：17 被引量：47H指数：4
- 供职机构：江苏大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学轻工技术与工程更多>>
- 杆状病毒ac68基因的克隆、表达与抗体制备
- 2010年
- 目的:对苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa califorica multicapsid nucleopoly hedrovirus,AcMNPV)开放阅读框68(open reading frame,ORF68,ac68)进行原核表达,制备该蛋白的多克隆抗体,为深入研究其功能提供基础。方法:将ac68基因克隆至原核表达载体pET28a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达Ac68蛋白,通过His抗体检测进一步验证所表达的蛋白为带有组氨酸的融合蛋白。以纯化的Ac68蛋白作为抗原,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。结果:实现了ac68基因的原核表达,获得了该蛋白的多克隆抗体并在AcMNPV感染的Sf-9细胞中检测到一条大小为25kD左右的特异杂交带。结论:获得的抗体可用于Ac68蛋白功能的进一步研究。
- 李国辉陈慧卿黄国平
- 关键词：苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒原核表达抗体
- 家蚕核型多角体病毒orf90基因在Bac-to-Bac家蚕杆状病毒系统中快速表达
- 2008年
- 【目的】利用BmNPV的Bac-to-Bac系统快速表达目的基因orf90,为深入研究该基因打下基础。【方法】将目的基因BmNPVorf90克隆到转移载体pFasBacHTb上,并将报告基因egfp插入到orf90的3'末端,形成重组转移载体pFasBacHTb-egfp-90。在将其转化到含穿梭载体bacmid的感受态细胞DH10Bac中,通过转座作用,经白斑筛选得到重组穿梭载体。纯化DNA,用脂质体介导转染家蚕BmN细胞,得到重组病毒bacmid-egfp-90。【结果】转染细胞72h后在荧光显微镜下可以观察到强烈的绿色荧光。重组病毒穿刺接种家蚕蛹,5d后观察到很强的荧光。结果表明构建的Bac-to-Bac系统能在家蚕细胞和蛹体中正确的快速表达外源基因。【结论】证明BmNPV的Bac-to-Bac是一个快速表达系统,适合在家蚕上广泛应用。
- 王强陈克平郭忠建姚勤王海燕陈慧卿
- 关键词：BMNPVEGFP基因
- 家蚕核型多角体病毒BmNPV囊膜蛋白P74膜外区克隆和原核表达被引量：2
- 2011年
- 通过PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)囊膜蛋白p74基因膜外区片段,对切胶纯化得到的DNA目的片段与原核表达载体pET28a进行连接,通过不同浓度的IPTG对含有pET28a-p74重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE电泳。结果表明p74基因膜外区获得了表达;通过His单抗对原核表达产物进行Western blotting分析,其结果证实诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对割胶获得的P74蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,以研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,通过收获的抗血清对BmNPV ODV病毒粒子进行West-ern blotting分析,检测到一条分子量大小为74 kD的特异杂交带,表明获得的多抗可用于P74蛋白功能的进一步研究。
- 李国辉唐琦胡朝阳陈慧卿
- 关键词：家蚕核型多角体病毒原核表达抗体制备
- Anti-CRISPR蛋白AcrVA2的结构生物学研究
- 2021年
- 大多数古生菌及半数细菌都含有成簇有规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关(CRISPR-associated,Cas)蛋白质构成的适应性免疫系统,来抵御外界噬菌体的入侵.而噬菌体为了对抗这种免疫系统,也进化出许多抗CRISPR(anti-CRISPR,Acr)的蛋白质,使得CRISPR-Cas系统受到抑制.来自牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)的AcrVA2是目前发现的可抑制V-A型CRISPR-Cas系统效应蛋白Cas12a发挥切割活性的Acr蛋白之一,其作用机理尚不清楚.本文解析了自由状态的AcrVA2和MbCas12a^(620-636)-AcrVA2复合物的晶体结构,发现AcrVA2蛋白采用了一种新的α-β折叠结构,且只与自由状态的Cas12a结合.此外,AcrVA2与MbCas12a^(620-636)的结合主要依靠氢键和盐桥的相互作用力,并通过疏水界面得到进一步稳定.这些结果提示,AcrVA2是通过与自由状态的MbCas12a结合来发挥抑制活性的,这对进一步理解Acr蛋白抑制V-A型CRISPR-Cas系统的多样化机制有重要意义.
- 陈鹏孙伟程志杨晶王敏王久宇陈慧卿刘亮王艳丽
- 关键词：晶体结构
- 家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达被引量：2
- 2011年
- 通过Primer Premier 5.0设计1对特异性引物,用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的部分DNA片段,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同样双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接;对捕获有重组质粒pET28a-GP64的大肠埃希菌BL21(DE3)细胞进行IPTG诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;通过His单抗对诱导产物进行Western Blot印迹分析,其结果表明诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对原核表达的GP64截短蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,将充分研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,以制备的GP64多抗对家蚕核型多角体病毒粒子感染的BmN细胞总蛋白进行Western Blot印迹分析,结果在杂交膜上出现一条特异杂交带、其分子量大小约为64 ku,表明制备的GP64多抗可用于其功能的进一步研究。
- 李国辉唐琦胡朝阳陈慧卿
- 关键词：家蚕核型多角体病毒原核表达抗体制备
- 家蚕羧酸酯酶基因克隆及差异表达被引量：13
- 2006年
- 家蚕浓核病毒(Bombyx moridensonucleosis virus,BmDNV)是蚕业生产上危害比较严重的一类病毒。用完全抗浓核病中国镇江株(BmDNV-Z)的家蚕品系秋丰、感性品系华八及以华八为轮回亲本回交8代和自交8代构建的近等基因系BC8为材料,采用mRNA荧光差显技术首次分离克隆了家蚕羧酸酯酶(B.moricarboxylesterase,BmCarE)基因全长cDNA,并用实时荧光定量PCR检测了添毒后12h、36h、72h BmCarE在感、抗BmDNV-Z家蚕品系中肠内的表达差异。结果表明:(1)添毒后12h不同品系家蚕中肠BmCarE表达差异最大,抗性品系BC8和秋丰分别是感性品系华八的17.714倍和3.602倍,三者彼此间的差异达到极显著水平;(2)同一品系添毒后12h与添清水后12hBmCarE表达也有较大差异,BC8添毒是BC8添清水的15.08倍,秋丰添毒是秋丰添清水的3.39倍,差异达到极显著水平,而华八添毒和添清水的BmCarE表达量均低,二者差异不显著;(3)同一品系添毒后不同时间BmCarE表达也有较大差异,BC8和秋丰添毒后12h BmCarE表达量最高,显著高于各自添毒后36h和72h表达水平,而添毒后36h与72h表达无显著差异;华八添毒后12h、36h和72h,BmCarE表达无显著差异。上述结果提示羧酸酯酶基因可能与家蚕抗浓核病毒有一定关系。
- 高贵田陈克平姚勤王林玲陈慧卿
- 关键词：家蚕近等基因系RT-PCR
- 细小病毒非结构蛋白NS1功能的研究进展被引量：5
- 2010年
- 介绍了细小病毒非结构蛋白NS1的生化特性,综述了近年来NS1蛋白与病毒复制、宿主细胞凋亡之间以及与基因表达调控之间的关系,并对NS1蛋白的进一步研究提出了建议。
- 张俊红李国辉陈慧卿黄国平姚勤
- 关键词：细小病毒非结构蛋白NS1
- 人源DNA聚合酶δ研究进展
- 2013年
- 在真核生物染色体DNA复制过程中主要涉及三种DNA聚合酶:α(Polα),δ(Polδ)和ε(Polε)。人源DNA聚合酶δ是p125,p68,p50,p12四个亚基构成的异源四聚体,属于DNA聚合酶B家族,具有5’-3’聚合酶催化活性和3’-5’核酸外切酶活性,是染色体DNA复制过程中最主要的复制酶,同时还参与多种形式的损伤修复,在保证基因组结构的完整性和遗传稳定性方面具有重要的意义。由于其重要的生物学功能,目前引起人们更多的关注和重视。对人源DNA聚合酶δ的分离纯化方法及涉及DNA复制和损伤修复过程中酶学功能等方面的最新研究进展进行综述。
- 张磊陈慧卿周亚竟
- 关键词：DNA聚合酶Δ分离纯化DNA复制DNA损伤修复
- 抗浓核病毒中国株家蚕品系中肠羧酸酯酶活力变化和基因表达差异的研究被引量：8
- 2007年
- 【目的】探讨家蚕中肠羧酸酯酶活力变化及羧酸酯酶基因表达差异与家蚕抗浓核病毒之间的关系,阐明其抗性的分子机理。【方法】以易感浓核病毒中国株家蚕品系华八和完全抗性品系BC8(华八的近等基因系)为材料,用BIO-TEK SYNERGY测定经口接种病毒(以下简称接种)后12h、36h、72h2个品系中肠的羧酸酯酶活力,并用实时荧光定量PCR研究接种后12h、36h、72h中肠羧酸酯酶基因的表达差异。【结果】接种后12h中肠羧酸酯酶活力BC8接种组分别是BC8对照组、华八接种组和华八对照组的3.28倍、2.26倍和3.02倍,差异达到极显著水平(P<0.01)其它时间段的供试组之间无统计学差异;接种后12h中肠羧酸酯酶基因的相对表达量BC8接种组分别是华八接种组、华八对照组、BC8对照组的17.714倍、21.76倍和15.09倍,差异达到极显著水平(P<0.01),其它时间段的供试组之间也无统计学差异。【结论】接种后12h抗性品系BC8中肠羧酸酯酶活力升高及中肠羧酸酯酶基因表达水平升高可能与家蚕品系是否有抗性基因(nsd/nsd)有关,也与浓核病毒中国株的感染刺激有关;抗性品系BC8中肠羧酸酯酶活力升高的分子基础可能是羧酸酯酶基因表达水平的改变。
- 高贵田陈克平姚勤陈慧卿王林玲徐家萍赵远王永杰
- 关键词：家蚕中肠羧酸酯酶酶活力
- 家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测
- 2016年
- DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。
- 陈慧卿楚茨周亚竟
- 关键词：DNA聚合酶重组蛋白酶活性
