刘铁
- 作品数：15 被引量：38H指数：4
- 供职机构：华中科技大学同济医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 鼠骨骺干细胞免疫纯化和pTRE-PTHrP（38-94）反应质粒的构建被引量：6
- 2008年
- 目的免疫纯化新生大鼠骨骺干细胞，克隆甲状旁腺相关蛋白的中间片段PTHrP（38-94）基因并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP（38-94）。方法采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的骨骺干细胞，分别以FGFR-3抗体和PCNA抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定。提取骨骺干细胞的总RNA，以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP（38-94）基因片段，扩增的DNA片段与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接，转化、扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果免疫荧光证实所取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞；经限制性内切酶Bam HⅠ、NotⅠ酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论运用显微取材和免疫纯化技术可以成功分离纯化骨骺干细胞；成功克隆PTHrP（38-94）基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP（38-94），为进一步明确PTHrP（38-94）片段的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础。
- 张树威陈安民游洪波廖晖宋登新王江谢柏臻刘铁郭风劲
- 关键词：干细胞免疫磁化分离
- 多种神经营养因子联合诱导培养骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞的定向分化(英文)被引量：3
- 2009年
- 背景:轴突再生后髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素,而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化。目的:探讨骨髓间充质干细胞经神经营养因子诱导培养后,向少突胶质样细胞定向分化的可行性。设计、时间及地点:细胞分子生物学的体外实验,于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成。材料:选用2～4周龄SD大鼠5只,雌雄不拘,取其双侧股骨、胫骨骨髓,分离培养骨髓间充质干细胞。培养用诱导因子表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子为美国Invitrogen公司产品。方法:取培养至第4代的骨髓间充质干细胞,加入含有20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20ng/mL表皮生长因子、N2添加剂的无血清培养基的诱导液诱导48h后,加含500ng/mL胰岛素样生长因子1、N2添加剂的分化培养液培养3d。主要观察指标:相差显微镜观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化。半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达。应用神经元细胞标志物抗微管相关蛋白,星形胶质细胞标志物抗神经纤维酸性蛋白,少突胶质细胞标志物抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质样细胞的阳性率。结果:①骨髓间充质干细胞向少突胶质样细胞诱导分化过程中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%,磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳�
- 许永涛李锋刘铁游洪波方忠
- 关键词：骨髓间充质干细胞胰岛素样生长因子少突胶质细胞分化
- 尿酸影响大鼠脊髓损伤后半胱氨酸蛋白酶3的表达及神经细胞凋亡被引量：1
- 2007年
- 目的:观察尿酸对大鼠脊髓损伤后损伤段半胱氨酸蛋白酶3的表达及神经细胞凋亡的影响。方法:实验于2005-07/12在同济医院矫形外科实验室完成。选用雌性SD大鼠55只,按随机数字表法分为3组,空白对照组5只,脊髓损伤组和尿酸处理组各25只。脊髓损伤组和尿酸处理组大鼠用改良的Allen’s打击法造脊髓损伤模型。空白对照组大鼠单纯切除椎板,不打击脊髓。脊髓损伤组和尿酸处理组大鼠分别于术后8h,24h,72h,7d,14d取材,每时点处死5只大鼠;空白对照组大鼠于术后8h处死取材。对损伤部位脊髓进行病理形态学观察;采用原位末端标记法标记凋亡细胞,计算凋亡细胞指数=凋亡细胞核数/总细胞核数;用免疫组化染色检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞。结果:纳入55只大鼠,全部进入结果分析,无脱失。①各组大鼠脊髓组织学检查结果比较:空白对照组大鼠脊髓未见出血、组织变性坏死等表现。与脊髓损伤组相比,尿酸处理组大鼠损伤脊髓出血坏死减少,炎性细胞浸润减轻。②各组大鼠脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数及神经细胞凋亡指数比较:相同时点尿酸处理组大鼠的神经细胞凋亡指数和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞数均显著低于脊髓损伤组(t=3.057～6.965,P<0.05)。结论:尿酸可以抑制脊髓神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,对损伤脊髓组织具有保护作用。
- 刘铁李锋关邯峰周松胡伟华
- 关键词：脊髓损伤尿酸细胞凋亡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶疾病模型
- 载TCG-β3基因的自组装肽支架与前软骨干细胞体外成软骨效应的研究
- 目的：
为研究关节软骨与骺板损伤的基因治疗创造条件，构建人转化生长因子β3（TGF-β3）的真核表达载体，并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs)，以获得组织工程的种子细胞。探讨稳定表达重组TGF-β3对前软骨干细胞（P...
- 刘铁
- 关键词：前软骨干细胞基因治疗真核表达载体种子细胞
- 文献传递
- hTGF-β3的构建及其在前软骨干细胞的瞬时表达被引量：3
- 2008年
- 目的为骺板损伤的基因治疗创造条件,构建人转化生长因子的真核表达载体,并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs),以获得组织工程的种子细胞。方法通过基因工程的方法重组构建pcDNA3.1(+)-hTGF-β3真核表达载体并鉴定,免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞后,用纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺共转染pcDNA3.1(+)-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP,观察和检测瞬时转染后的表达情况。结果重组质粒经过酶切电泳和测序鉴定证实构建成功,共转染后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,RT-PCR和ELISA可以检测到有目的基因的表达。转染后培养液上清中TGF-β3蛋白含量开始上升,在72h达到高峰,以后逐渐下降。结论真核表达载体hTGF-β3的重组质粒构建正确,并成功转染PSCs,为骺板损伤的组织工程学修复提供了新的选择。
- 刘铁游洪波陈安民许永涛李锋
- 关键词：转化生长因子Β3前软骨干细胞聚乙烯亚胺
- 具有软骨诱导活性的新型基因活性基质材料的制备被引量：1
- 2008年
- 目的制备具有软骨诱导活性的新型基因活性基质材料,以促进种子细胞定向分化。方法用固相法合成KLD-12多肽并通过高压液相色谱及质谱仪纯化并鉴定;取0.5%(w/v)多肽在生理溶液条件自组装成多肽凝胶状物质,将TGF-β3质粒与KLD-12多肽间非共价键结合负载质粒并检测其DNA释放能力。结果KLD-12多肽序列合成成功,其相对分子质量为1466.9 Da;携TGF-β3基因的自组装肽凝胶支架的基因释放DNA含量于3 d内达高峰,2周内可维持在较高水平。结论携TGF-β3基因自组装肽凝胶基质材料成功合成;此材料可诱导种子细胞定向增殖分化,促进软骨组织修复。
- 刘铁李锋游洪波
- 关键词：转化生长因子
- 骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化被引量：6
- 2008年
- 目的:神经反射通路的重建和再髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素,而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化。探讨骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的可行性。方法:实验于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成。①动物:2～4周龄清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法:大鼠颈脱臼法处死,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,去除两端骨骺,暴露骨髓腔,用DMEM培养液反复冲洗,收集冲洗液,重悬细胞种植于25cm2培养瓶中,培养体系中含DMEM、体积分数为0.1的胎牛血清、终浓度为2mmol/L谷氨酰胺及100U/mL青霉素和100mg/L链霉素,采用贴壁法+胰蛋白酶消化法进行纯化。取培养至第4代的骨髓间充质干细胞,加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、N2添加剂的无血清培养基进行诱导分化。③实验评估:观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化。半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达。应用抗微管相关蛋白、抗神经纤维酸性蛋白、抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色,检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质细胞的阳性率。结果:①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化:经诱导分化后,大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征,胞质向细胞核回缩,细胞突起向外延伸,折光性增强,随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达:细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率:在诱导分化条件下,半乳糖脑苷脂阳性率为65%,磷脂碱性蛋白阳性率为45%,微管相关蛋白2阳性率为10%。结论:碱�
- 许永涛李锋刘铁游洪波方忠
- 关键词：骨髓间充质干细胞胰岛素样生长因子少突胶质细胞分化
- 硫酸镁对大鼠急性脊髓损伤组织的保护作用
- 2006年
- 目的观察硫酸镁对急性脊髓损伤SD大鼠的保护作用,并分析不同剂量硫酸镁对损伤组织的保护作用。方法将48只成年SD大鼠随机分为4组:损伤对照组和低、中、高剂量实验组。所有大鼠分别在T9~11处建立A llen重物坠落脊髓打击模型,模型建立后,低、中、高剂量实验组大鼠分别腹腔注射硫酸镁溶液100,300和600 mg.kg-1,损伤对照组腹腔注射等体积的0.9%氯化钠溶液。每只大鼠给药1 mL,在不同的时间点(8,24,72 h),每组分别处死大鼠4只。取材后,观测脊髓组织中丙二醛(MDA)浓度和过氧化物分歧化酶(SOD)活性,以及损伤脊髓组织的病理学改变。结果低剂量实验组与损伤对照组比较,MDA含量、SOD活性和细胞凋亡指数差异无显著性(P>0.05)。中、高剂量实验组与损伤对照组比较,MDA含量降低,SOD活性增强,差异分别有显著性和极显著性(P<0.05或P<0.01);细胞凋亡指数随着时间延长,差异逐渐变大,差异分别有显著性和极显著性(P<0.05或P<0.01)。结论硫酸镁对急性脊髓损伤组织起到保护作用,保护作用大小呈剂量依赖性。
- 周松刘铁张帆胡伟华陈超李锋
- 关键词：硫酸镁
- 尿酸对大鼠脊髓损伤后保护作用的实验研究被引量：1
- 2007年
- 目的观察尿酸(uricacid,UA)对大鼠脊髓损伤后继发性损害的保护作用。方法成年雌性SD大鼠随机分成3组:空白对照组,脊髓损伤组,UA干预组。UA干预组在脊髓损伤造模前1h和造模成功后4h经腹腔给予UA500mg·kg-1(用0.9%氯化钠溶液配成悬浮液),空白对照组和脊髓损伤组在同样时点经腹腔注射0.9%氯化钠溶液。在脊髓损伤后8,24,72h和7d,对损伤部位脊髓组织丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)的活性进行检测及病理形态学观察,并采用原位末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞。结果与脊髓损伤组比较,UA干预组大鼠各时间点损伤部位脊髓组织中MDA含量较脊髓损伤组明显下降(P<0.05),SOD的活性较脊髓损伤组有明显升高(P<0.05)。病理形态结构改善,神经细胞凋亡减少。结论UA可以抑制脊髓损伤后自由基的损伤作用,减少神经细胞凋亡,对损伤脊髓组织具有保护作用。
- 刘铁周松张帆关邯锋陈超李锋
- 关键词：尿酸脊髓损伤细胞凋亡
- 载TGF-β3基因的自组装肽支架与前软骨干细胞体外成软骨效应的研究
- 目的： 为研究关节软骨与骺板损伤的基因治疗创造条件，构建人转化生长因子β3(TGF-β3)的真核表达载体，并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs)，以获得组织工程的种子细胞。探讨稳定表达重组TGF-β3对前软骨干细胞(PSCs...
- 刘铁
- 关键词：转化生长因子Β3前软骨干细胞干细胞转化生长因子基因
