吴向玲
- 作品数：6 被引量：4H指数：2
- 供职机构：南方医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广州市科技计划项目长江学者和创新团队发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Hela细胞穿透肽的筛选和初步鉴定
- 目前,肿瘤治疗中存在的最大问题是药物杀伤肿瘤细胞的特异性不强,经常在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也造成了致死性的破坏,所以研制靶向性抗肿瘤药物成为当今肿瘤研究领域的热点。由于细胞膜的脂质双分子层结构具有透过选择性,已研究...
- 吴向玲
- 关键词：噬菌体展示内吞细胞筛选生物信息学
- 文献传递
- 具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定
- 2010年
- 目的建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统。方法应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒。将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能。结果所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的融合蛋白。细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性。结论成功构建了pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体,并获得了具有良好穿透真核细胞膜功能的融合蛋白,为进一步研究细胞内蛋白相互作用、细胞穿透肽TAT的功能及其穿透细胞的机制奠定了基础。
- 邓鹏刘芸李涛吴向玲刘亚伟姜勇
- 串联亲和纯化标记的HMGB1细胞因子诱导片段1融合表达载体构建和蛋白纯化及其功能初步探讨
- 2009年
- 目的:构建高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中细胞因子诱导片段1(CIF1)与串联亲和纯化(TAP)系统中纯化标签链霉亲和素结合肽(SBP)和钙调蛋白结合肽(CBP)序列相融合的原核表达载体,观察重组蛋白对小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,为HMGB1参与炎症反应作用机制的研究以及CIF1结构域细胞膜表面受体蛋白的获得和鉴定奠定基础。方法:采用PCR方法分别扩增出CBP-SBP和CIF1的编码序列,构建表达质粒pET-14b/CBP-SBP-CIF。利用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白,纯度达85%以上。采用纯化后的蛋白诱导小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞RAW264.7,利用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测RAW264.7细胞释放TNF-α的水平变化。结果:表达载体构建正确,CIF1重组蛋白表达量高,纯度好。当蛋白浓度大于0.5ng/μl时,CIF1重组蛋白诱导细胞TNF-α的分泌量与对照组相比差异具有显著性(P<0.05),并且在CIF1蛋白浓度0～2.5ng/μl范围内,TNF-α的分泌量与CIF1重组蛋白的浓度呈显著的剂量依赖关系。结论:原核表达纯化了His-CBP-SBP-CIF1融合蛋白,该融合蛋白可以有效地作用于巨噬样细胞内的信号转导过程,介导了炎症因子TNF-α的分泌表达。
- 刘芸邓鹏刘铮徐佳吴向玲姜勇
- 关键词：高迁移率族蛋白B1
- 人宫颈癌Hela细胞穿透肽的噬菌体展示技术筛选被引量：2
- 2009年
- 目的细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透哺乳动物生物膜功能,并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子肽段。该肽段以其转导效率高,速度快,生物活性好,对细胞损害小等特点,成为药物导向治疗方法研究领域的热点。本研究目的在于利用噬菌体展示技术高通量、系统地筛选人宫颈癌Hela细胞的穿透多肽。方法以Hela细胞作为对象,利用噬菌体随机肽库,采用细胞筛选的方法,筛选具有细胞膜穿透作用的多肽。将筛选得到的穿透多肽与增强型绿色荧光(EGFP)融合表达,通过荧光显微观察技术快速对多肽的穿透功能进行验证。结果通过4轮的噬菌体文库筛选,目的多肽得到了有效而快速地富集。初步的测序和验证得到了3条具有明显介导融合蛋白内化的短肽序列。结论成功建立起基于噬菌体随机肽库的细胞穿透肽筛选技术,为肿瘤导向药物载体的研究开发奠定了基础。
- 刘芸吴向玲江力玮姚琦邓鹏姜勇
- 关键词：细胞穿透肽噬菌体展示
- SARS冠状病毒S2蛋白胞外段的原核表达及其细胞膜融合效应研究
- 2009年
- 目的构建SARS冠状病毒S2蛋白胞外段(S2ED)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合蛋白表达质粒,获得在原核细胞中表达的目的蛋白。方法在生物信息学预测基础上,利用PCR方法扩增S2ED和EGFP的编码序列,插入到质粒pET-14b中构建融合表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白His-S2ED-EGFP。采用Ni-NTA亲和树脂纯化融合蛋白可溶部分,利用SDS-PAGE和免疫印迹的方法鉴定纯化后的蛋白,通过荧光显微镜考察S2ED与Hela细胞胞膜能否发生融合效应。结果重组质粒pET-14b-S2ED-EGFP的构建正确无误,并能够在BL21(DE3)中高效表达。纯化后的蛋白与Hela细胞孵育后,未观察到蛋白通过膜融合的过程内化进入细胞。结论S2ED的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功,并在原核细胞中获得了部分可溶的表达和有效的纯化。虽然原核表达的重组蛋白未能在Hela细胞上发挥预期的生物学效应,但是该工作将为加深S2蛋白介导的胞膜融合过程的认识以及未来进行以特异性细胞结合肽为基础的定向靶细胞转运系统研究奠定重要的基础。
- 刘芸刘爱华邓鹏吴向玲李涛刘亚伟徐佳姜勇
- 关键词：SARS冠状病毒S2蛋白胞外段蛋白表达
- 穿透肽TAT融合表达载体的优化及其靶向应用的初步研究被引量：2
- 2010年
- 目的设计并构建分别位于融合蛋白氨基端和羧基端的穿透肽TAT表达载体,比较两种融合蛋白的内化差异,并利用TAT将凋亡素VP3转导入细胞内,检测其促凋亡活性。方法荧光显微镜观察His-TAT-EGFP和His-EGFP-TAT融合蛋白内化效率的差异,并利用Western blotting检测内化入细胞的蛋白量。将VP3序列插入到内化效率高的穿透肽载体pET14b-EGFP-TAT中并诱导表达蛋白,观察该蛋白在不同细胞系(HeLa、HEK293、3T3、PC-3)的内化;利用DAPI染色观察该融合蛋白诱导HeLa细胞凋亡后核小体的形成,MTT法检测细胞存活率。结果在蛋白浓度梯度实验中,荧光显微镜观察和Western blotting检测均显示His-EGFP-TAT融合蛋白的内化效率明显高于His-TAT-EGFP融合蛋白。在不同种类细胞中均可观察到His-VP3-EGFP-TAT内化的强荧光颗粒;该蛋白和对照蛋白(His-EGFP-TAT)孵育HeLa细胞48h后,His-VP3-EGFP-TAT孵育细胞中可观察到核小体形成,MTT法检测该组细胞的存活率在500、1000、2000nmol/L蛋白作用下分别为87.23%±2.09%、53.01%±1.79%和42.52%±1.90%,与His-EGFP-TAT孵育细胞存活率(分别为97.21%±1.41%、95.72%±1.26%和94.35%±1.67%)比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 TAT位于融合蛋白羧基端的蛋白内化活性高于位于氨基端的蛋白,His-VP3-EGFP-TAT融合蛋白可以高效内化进入不同的细胞系,并能有效诱导细胞凋亡。
- 吴向玲刘芸邓鹏姜勇
- 关键词：细胞凋亡
