尤琳烽
- 作品数：14 被引量：24H指数：3
- 供职机构：华南农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学理学更多>>
- 一种多基因载体组装方法与应用
- 本发明公开了一种多基因载体组装方法与应用，属于基因工程技术领域。该方法包括如下步骤（1）采用含有酶切位点的重叠引物对三个基因片段进行PCR扩增，通过1.33×连接buffer将三个片段连接成重组质粒；（2）重组质粒含有单...
- 林俊芳杨海星郭丽琼尤琳烽
- 一种DBAT突变酶R363H及其应用
- 本发明公开一种DBAT突变酶R363H及其应用。所述的突变酶是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由Arg改变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO：14。本发明成功构建出突变酶R363H...
- 林俊芳郭丽琼尤琳烽叶志伟黄佳俊
- 文献传递
- 灰盖鬼伞组合表达紫杉醇生物合成酶基因的研究
- 紫杉醇是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种次生代谢物,具有显著抗癌效果,是目前应用最广泛的天然抗癌药物之一.但因资源匮乏,单纯从含量甚微的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床需求,故紫杉醇的药源问题已引起人们的极大...
- 尤琳烽郭丽琼卢俊南林俊芳黄秀琴
- 关键词：紫杉醇灰盖鬼伞代谢工程
- 银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定被引量：7
- 2012年
- 利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。
- 聂燕华林俊芳王杰尤琳烽郭丽琼
- 关键词：银耳芽孢
- PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立被引量：14
- 2014年
- 对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为:液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI‐hph(含有灵芝gpd1‐Gl启动子和潮霉素抗性基因hph)转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。
- 刘莉肖招燕郭丽琼林俊芳尤琳烽廖静文
- 关键词：猴头菌原生质体制备
- 一种DBAT突变酶D166H及其应用
- 本发明公开一种DBAT突变酶D166H及其应用。所述的突变酶D166H是氨基酸序列为SEQ？ID？NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp改变为His；其氨基酸序列为SEQ？ID？NO：6。该突变酶在利用乙酰辅酶A...
- 郭丽琼林俊芳尤琳烽黄佳俊叶志伟
- 文献传递
- 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达
- 2015年
- 紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。
- 尤琳烽杨海星林俊芳柳永叶志伟郭丽琼辛燕花
- 关键词：灰盖鬼伞组合生物合成
- 紫杉二烯合酶基因在灵芝中的表达被引量：3
- 2014年
- 【目的】论文旨在研究紫杉二烯合酶基因(ts)在灵芝中的表达情况,为利用灵芝作为生物反应器表达紫杉醇及其中间产物提供科学理论依据。【方法】制备灵芝菌株的原生质体:把培养好的灵芝菌丝用0.6 mol·L-1的甘露醇溶液洗涤两次后,加入1%溶壁酶溶液,30℃水浴酶解3 h,离心去上清液得到纯的灵芝原生质体,用0.6mol·L-1的甘露醇溶液把原生质体的浓度调整到108个/mL备用;外源基因(ts)的转化:在含有灵芝原生质体的缓冲液各加入含有ts基因和潮霉素抗性基因hph的真核表达载体pgGIgpd-TS和pBgGI-hph 1.0μg,冰浴30 min;加入0.5 mL PEG buffer,在室温下放置20 min;将离心收集的原生质体涂布在不含有潮霉素的再生平板上,25℃培养5—7 d后,待长出白色菌落后,往平板表层覆盖一层含有潮霉素的PDA半固体培养基,于25℃培养;转化子的鉴定:以灵芝的菌丝基因组DNA和RNA为模板,进行PCR和RT-PCR扩增,鉴定ts基因在灵芝中的表达情况;目标产物的检测:对提取的产物采用不分流进样的方式进行气相质谱联用(GC-MS)检测,进样温度250℃,初始温度100℃,保留1 min,每分钟升高8℃,加热到300℃,保留2 min。【结果】经潮霉素初步筛选后,在含有潮霉素抗性的平板上长出白色的菌落,灵芝原种作为阴性对照的平板上没有长出菌落,说明潮霉素基因被成功转入了灵芝并得到了初步的表达;PCR鉴定结果表明20个拟转化子中有4个转化子同时整合了ts基因和hph基因,两个基因的共转化率为20%;RT-PCR鉴定结果表明,4个灵芝转化子实现了外源ts基因的转录;提取转ts基因灵芝的菌丝产物;经过GC-MS测定分析表明,与原种相比,含有ts基因的灵芝工程菌株有一个明显的差异峰,对该峰进行离子碎片分析表明,该物质为紫衫二烯,说明在含有ts基因的灵芝菌丝体中含有目标产物紫衫二烯。【结论】灵芝作为大型真菌,首次被证实可以通过代谢
- 辛燕花肖招燕尤琳烽郭丽琼林俊芳
- 关键词：灵芝
- 一种DBAT突变酶D166H及其应用
- 本发明公开一种DBAT突变酶D166H及其应用。所述的突变酶D166H是氨基酸序列为SEQ ID NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp改变为His；其氨基酸序列为SEQ ID NO：6。该突变酶在利用乙酰辅酶A...
- 郭丽琼林俊芳尤琳烽黄佳俊叶志伟
- 文献传递
- 一种DBAT突变酶D166HR363H及其应用
- 本发明公开一种DBAT突变酶D166HR363H及其应用。该突变酶是氨基酸序列为SEQ？ID？NO：2的DBAT酶的第166位氨基酸由Asp变为His，第363位氨基酸由Arg变为His；其氨基酸序列为SEQ？ID？NO...
- 林俊芳黄佳俊郭丽琼尤琳烽叶志伟
- 文献传递
