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韩秋影: 作品数：20 被引量：20H指数：3; 供职机构：军事医学科学院国家生物医学分析中心更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划全球变化研究国家重大科学研究计划更多>>; 相关领域：生物学医药卫生理学机械工程更多>>

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去氧紫草素对小鼠原代神经元线粒体自噬的影响被引量：2: 2022年; 目的基于定位于线粒体上的Keima(mt-Keima)荧光蛋白研究去氧紫草素对小鼠神经元线粒体自噬的影响。方法分离mt-Keima转基因和C57BL/6野生型胚胎小鼠大脑皮质神经元(分别命名为mt-Keima神经元和C57BL/6神经元)。用激光共聚焦显微镜观察mt-Keima神经元在561和458 nm激发波长下荧光信号,鉴定mt-Keima神经元mt-Keima荧光蛋白的表达。用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1 100 nmol·L^(-1)处理mt-Keima神经元24 h,用激光共聚焦显微镜观察神经元内的荧光信号,分析561和458 nm激发波长下荧光强度比值,检测mt-Keima神经元评价线粒体自噬的可靠性。去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理mt-Keima神经元24 h,用激光共聚焦显微镜观察神经元荧光变化,分析561和458 nm激发波长下荧光强度比值,评价去氧紫草素对线粒体自噬活性的影响。去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理C57BL/6神经元24 h,免疫荧光法检测C57BL/6神经元线粒体外膜受体蛋白Tom20的表达,四甲罗丹明甲酯染料染色后用激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化。结果激光共聚焦显微镜结果显示,分离的mt-Keima神经元表达mt-Keima蛋白。与二甲亚砜(DMSO)对照组相比,巴弗洛霉素A1 100 nmol·L^(-1)处理组561和458 nm激发波长下的荧光强度比值下降(P<0.01),表明线粒体自噬水平降低,mt-Keima神经元可用于检测神经元线粒体自噬活性。与DMSO对照组相比,去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理组mt-Keima神经元在561和458 nm激发波长下荧光强度比值增强(P<0.01),表明mt-Keima神经元线粒体自噬水平增加。免疫荧光结果表明,去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理,可使C57BL/6神经元Tom20蛋白表达降低(P<0.01);激光共聚焦显微镜观察结果显示,去氧紫草素100 nmol·L^(-1)处理,对C57LB/6神经元线粒体膜电位无明显影响。结论去氧紫草素在不造成线粒体损伤的前提下可促进小鼠原代神经元线粒体自噬。; 路丁乙李婷姚铖铖陈佳意赵洁韩秋影李爱玲潘欣; 关键词：线粒体神经元

干涉Gankyrin基因表达对小鼠乳腺癌转移的影响被引量：2: 2013年; 目的建立稳定干涉癌基因Gankyrin的4T1-luc细胞株，探讨Gankyrin对小鼠乳腺癌转移的影响。方法采用慢病毒感染和抗性筛选方法获得稳定干涉Gankyrin的乳腺癌细胞株4T1-luc／shGankyrin，通过蛋白质印迹和实时定量PCR方法分别在蛋白质和mRNA水平检测Gankyrin的干涉效果；选用BALB／c小鼠进行4T1细胞原位种植，利用活体成像技术实时观测小鼠体内肿瘤生长和肿瘤转移情况，并对小鼠肺转移瘤进行病理学分析。结果采用免疫印迹和实时定量PCR，检测稳定敲低Gankyrin4T1细胞在蛋白质水平和mRNA水平的表达，均明显低于对照细胞，与对照细胞相比，不同干涉序列的4T1细胞mRNA水平分别为对照细胞的4．9％、25．1％、69．8％。利用活体成像进行细胞数与细胞发光强度的检测，选择细胞数与发光强度基本一致的#2细胞株进行小鼠原位种植，其产生的转移瘤进行实时观测，结果显示敲低Gankyrin的4T1细胞诱导的肺转移瘤荧光强度为3．02×10^6，而对照细胞为10．9×10^6，同时病理学证实了对照细胞产生的肺转移瘤免疫组织化学Gankyrin染色阳性，而敲低Gankyrin的4T1细胞的肺转移瘤免疫组织化学Gankyrin染色阴性。结论采用慢病毒感染的方法可以有效建立稳定敲低Gankyrin表达的细胞株；Gankyrin稳定干涉后对小鼠乳腺癌转移具有明显的抑制作用。Gankyrin有可能成为新的肿瘤治疗靶点。; 王少鑫巩伟丽韩秋影满江红靳宝锋; 关键词：慢病毒感染肿瘤转移

实时无标记肿瘤细胞迁移筛选技术体系的建立被引量：1: 2013年; 肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的最主要原因。细胞迁移在多步骤、多阶段的肿瘤转移过程中发挥着重要的作用。尽管有许多迁移相关分子的研究,但细胞迁移的分子机制仍不清楚。研究将xCELLigence细胞分析系统和RNA干扰技术结合,初步建立了实时无标记的肿瘤细胞迁移筛选技术体系。该技术体系的建立将为大规模的肿瘤细胞迁移筛选工作奠定基础,还将有助于发现肿瘤细胞迁移信号通路中新的调控分子,揭示肿瘤转移的分子机制。; 赵青穆蕊王少鑫韩秋影巩伟丽满江红; 关键词：肿瘤转移细胞迁移 RNA干扰

HeLa/GFP—H2B细胞系的构建及对其有丝分裂进程的动态观察被引量：3: 2011年; 准确的染色体分离依赖于有丝分裂过程的精确调控,包括有丝分裂的时间,及纺锤体检查点的正确调控等。通过动态观察有丝分裂染色体的运动可对上述研究进行精确定量。结果显示,利用逆转录病毒系统成功构建了稳定融合表达绿色荧光蛋白GFP—H2B的HeLa细胞系,结合细胞同步化方法,建立了一套利用活细胞荧光共聚焦显微镜观察HeLa细胞有丝分裂的实验体系。; 李腾高彦飞常艳王玉博穆蕊陈亮甄诚韩秋影于鸣巩伟丽张维娜李慧艳; 关键词：有丝分裂细胞同步化

体外APC/C活性体系的建立及其影响因素的研究: 2011年; 为获得具有细胞周期后期促进复合物(APC/C)活性的细胞裂解液并建立APC/C体外活性检测体系,以其底物Cyc-lin B及Securin的降解为检测指标,分别从细胞阻滞于有丝分裂期的时间,UBCH10(APC/C的E2酶)的浓度以及裂解液浓度等几个方面研究了各种处理因素对APC/C活性的影响,并且用体外翻译底物验证了其活性及相关结论。此项工作为进一步探索APC/C相关分子事件奠定了基础。; 高彦飞李腾常艳王玉博穆蕊陈亮甄诚韩秋影于鸣巩伟丽张维娜李慧艳; 关键词：CYCLIN SECURIN UBCH10 活性

基于单细胞荧光成像技术的昼夜节律监测分析被引量：1: 2023年; 昼夜节律作为机体的无形时钟精密调控多种生理功能,包括睡眠、觉醒、大脑认知、免疫力等。下丘脑视交叉神经上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)作为昼夜节律系统的主起搏器,能够自主产生节律性输出信号,协调维持全身多个组织、器官的时钟变化。同时,SCN通过神经元间的耦合作用,实现不同神经细胞节律性变化的步调一致性,产生强劲的振荡性规律,以维持机体内部节律稳定、抵抗外界环境因素干扰。为直观的研究SCN区在机体昼夜节律中的功能,实现单细胞尺度观测SCN神经元节律性变化,本研究搭建了单细胞荧光成像系统,通过深度制冷CCD相机,利用荧光素酶报告基因系统,对体外分离培养的SCN脑片进行长周期实时成像,原位观察SCN区不同细胞节律基因的振荡性表达规律。利用Eviews、IgorPro等软件,对荧光强度在单细胞尺度及时间尺度上进行量化分析,最终实现了在单细胞水平监测观察节律基因的振荡性变化。利用河豚毒素(TTX)能够可逆性的破坏SCN细胞间的耦合作用,验证了该系统的可行性。综上,本研究成功搭建了基于荧光素酶报告基因系统的单细胞实时荧光成像平台及分析技术,实现了对SCN神经元基因表达节律性变化的实时监测。; 李森许钰铃王佳荣李佩瑶何春雨于希平李慧艳张宇程胡怀斌宋增庆王凯韩秋影涂海情; 关键词：昼夜节律 SCN 荧光素酶 CCD 实时成像

Mad2蛋白在有HeLa细胞有丝分裂期的动态定位: 2011年; 在细胞有丝分裂中纺锤体检查点对保证遗传信息的稳定性有着重要的调控意义。其中Mad2蛋白作为纺锤体检查点蛋白在前中期被招募到未与微管正确结合的着丝粒上,从而保证纺锤体检查点的激活并抑制后期的开始。通过活细胞荧光共聚焦显微镜对Mad2的定位动态追踪,定量了其在有丝分裂过程中位于着丝粒上的光强变化,从而为研究纺锤体检查点的功能提供了依据。而Mad2本身的蛋白表达过强过弱均可导致肿瘤的发生,因此通过对其有丝分裂中光强的定量也为研究肿瘤的发生机制提供了线索。; 李腾高彦飞常艳王玉博穆蕊陈亮甄诚韩秋影于鸣巩伟丽张维娜李慧艳; 关键词：MAD2 有丝分裂

肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆疾病相关9号染色体开放阅读框72基因(C9orf72)突变产物二肽重复蛋白对HeLa细胞线粒体生物学功能的影响: 2021年; 目的探究肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆疾病相关9号染色体开放阅读框72基因(C9orf72)内六核苷酸GGGGCC重复序列非常规翻译产物二肽重复蛋白聚-脯氨酸-精氨酸(poly-PR)、聚-甘氨酸-丙氨酸(poly-GA)和聚-甘氨酸-精氨酸(poly-GR)对线粒体生物学功能的影响。方法首先将重复4次的人细胞色素c氧化酶亚基Ⅷ线粒体定位序列(4mt)分别插入到含二肽重复50次的pEGFP-C1-PR50,-GR50和-GA50质粒上,将该重组质粒经测序和双酶切鉴定后转染293T细胞,通过Western印迹法检测293T细胞二肽重复蛋白PR50,GR50和GA50表达水平。随后将上述重组质粒用Lipofectamine 2000分别转染HeLa细胞,通过四甲罗丹明甲酯(TMRM)和线粒体超氧化物红色荧光探针(MitoSOX)染色,用宽场荧光显微成像检测二肽重复蛋白PR50,GA50和GR50对HeLa细胞线粒体形态、数目、膜电位和氧化应激水平的影响。通过慢病毒感染HeLa细胞和嘌呤霉素筛选获得稳定表达PR50,GA50和GR50的细胞系,用ATP检测试剂盒检测PR50,GR50和GA50对细胞内ATP水平的影响。结果成功构建带有线粒体定位序列的4mt-EGFP-C1及4mt-EGFP-C1-PR50,-GR50和-GA50重组质粒。Western印迹法鉴定结果显示,二肽重复蛋白PR50,GA50和GR50在293T细胞中表达正确。线粒体功能评价实验结果表明,与4mt-EGFP-C1对照组相比,PR50和GR50过表达可使HeLa细胞线粒体形态改变,线粒体数目显著增加(P<0.05),线粒体膜电位降低(P<0.05,P<0.01),氧化应激反应增强(P<0.05,P<0.01),ATP水平下降(P<0.05);而GA50过表达则对线粒体功能无影响。结论富含精氨酸的二肽重复蛋白PR50和GR50进入线粒体,可损伤线粒体生物学功能。; 张亚昆高俊韩秋影潘欣李爱玲李腾; 关键词：肌萎缩侧索硬化症额颞叶痴呆线粒体

阿司咪唑对宫颈癌细胞HeLa自噬的影响被引量：2: 2018年; 该研究利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)、稳定表达m Cherry-EGFP-LC3B(microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3)自噬双标荧光细胞、mt-Keima荧光探针活细胞扫描技术在人宫颈癌细胞He La中检测了多种自噬相关标志物,探究了阿司咪唑(astemizole,AST)对He La细胞自噬的影响。结果表明,阿司咪唑在He La细胞中引起自噬标志蛋白质LC3-II与SQSTM1/p62的显著累积,并存在剂量和时间依赖性效应;阿司咪唑导致He La细胞存活率显著降低;用自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf-A1)阻断自噬流(autophagic flux)后,再加入阿司咪唑不能促进LC3-II进一步累积;阿司咪唑处理细胞后自噬体与自噬溶酶体的数量均显著增加;此外,阿司咪唑显著抑制了线粒体氧化磷酸化解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)导致的线粒体标志蛋白质TOMM20(translocase of outer mitochondrial membrane 20)的降解,其线粒体自噬水平显著低于对照组。以上结果证明了阿司咪唑有抑制自噬流的作用,导致损伤的线粒体不能被顺利降解,并且提示该作用可能是通过抑制溶酶体功能实现的。; 赵菲徐广陈佳意李婷韩秋影张学敏潘欣; 关键词：自噬阿司咪唑线粒体

慢病毒感染方法构建稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系被引量：3: 2013年; PDRG1(p53 and DNA-damage regulated 1)是实验室通过文库筛选发现的参与NF-kB信号通路调控的一个新基因。已知PDRG1在多种肿瘤中高表达,并参与p53信号通路;同时该基因受UV以及基因毒性等刺激调控。但其在NF-κB信号通路中作用尚未见报道,为了深入研究PDRG1对NF-κB信号通路的调控机理,构建了稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系。选择了基于慢病毒载体pLKO.1的感染体系,该慢病毒体系可以同时感染分裂期与非分裂期的细胞,将目的基因干涉序列稳定整合至靶细胞基因组中;再经过抗生素压力筛选后在短时间内获得稳定干涉目的基因表达的细胞株。设计合成PDRG1干涉序列并克隆至pLKO.1载体,转染病毒包装细胞293TN后收集慢病毒上清感染HeLa细胞系,进一步经过嘌呤霉素压力筛选成功获得稳定表达PDRG1干涉序列的细胞株。该稳定细胞株的建立为PDRG1的功能研究提供了必要的实验工具。; 巩伟丽徐广韩秋影陈媛; 关键词：慢病毒感染

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