褚贝贝
- 作品数：44 被引量：37H指数：4
- 供职机构：河南农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项转基因生物新品种培育专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学文化科学医药卫生更多>>
- PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究被引量：4
- 2019年
- TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。
- 刘晓贺巴根李坚韩莹倩张爽明胜利杜永坤褚贝贝杨国宇王江
- 关键词：猪伪狂犬病病毒
- 溶酶体与过氧化物酶体形成膜接触介导胆固醇转运被引量：2
- 2015年
- 胆固醇是真核细胞中含量非常丰富的一类脂质小分子,其主要生物学功能是掺入到磷脂双分子层中,调节膜的性质。胆固醇在细胞内不同膜上的分布极不均匀而且高度动态运输,这对维持细胞的正常生命活动至关重要。然而,细胞内胆固醇运输的机制一直不清楚。针对这一胆固醇代谢领域的重要问题,同时也是一个基本的细胞生物学问题,通过巧妙设计、全基因组筛选,鉴定出341个参与细胞内胆固醇转运的候选基因,其中,过氧化物酶体相关基因被显著富集。进而发现溶酶体通过和过氧化物酶体相互接触,将胆固醇转移给后者。而介导该接触的分子分别是溶酶体上的Synaptotagmin VII(Syt7)和过氧化物酶体膜上的PI(4,5)P2磷脂。将这种新发现的溶酶体–过氧化物酶体膜接触命名为LPMC(lysosome-peroxisome membrane contacts)。过氧化物酶体功能缺失会导致一大类相关疾病—过氧化物酶体紊乱疾病,表现为发育和神经系统功能障碍,目前还没有有效的治疗手段。该工作第一次揭示在这些病人和小鼠模型的细胞中有大量胆固醇堆积,且该现象的出现大大早于神经症状,提示胆固醇堆积是过氧化物酶体紊乱疾病的发病原因之一。这项研究工作的意义在于:(1)发现了细胞内胆固醇运输的新途径;(2)揭示了过氧化物酶体这一细胞器的新功能;(3)证明胆固醇运输异常是导致过氧化物酶体紊乱疾病的病因之一,为治疗该类疾病提供了全新的思路。
- 褚贝贝宋保亮
- 关键词：胆固醇溶酶体过氧化物酶体
- 猪伪狂犬病病毒变异株HN1201 gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
- 2023年
- 旨在获得用于伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)实验室检测和临床诊断所需的PRV gE单克隆抗体,用灭活的PRV变异株PRV HN1201免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验(immune peroxidase monolayer assay,IPMA)和免疫印迹试验(Western blot)筛选,获得2株分泌PRV gE抗体的杂交瘤细胞(1-F11-3、3-E11-3),抗体亚类分别为IgG2a和IgM,轻链均为Kappa链。间接免疫荧光试验(IFA)检测结果显示单克隆抗体可与不同PRV毒株反应,而不与PRV Bartha K61反应;Western blot、IPMA、IFA试验结果显示2株单克隆抗体均能特异性识别PRV gE蛋白,与其他病毒无交叉反应。Western blot试验鉴定2株抗体的抗原识别序列分别为^(64)GDDRRAGFGSALASLR^(79)和^(156)PPEVPRLRRGPPIVTPERWS^(175)。腹水纯化后的1-F11-3、3-E11-3抗体用于Western blot检测的最高稀释比分别为1∶14000和1∶12000,1-F11-3的IFA效价为2^(-14),3-E11-3不可用于IFA检测。结果表明,本研究制备的PRV gE抗体特异性强、灵敏度高,为建立快速、高效的PRV免疫学检测方法奠定了基础。
- 牛欣蕊付朋飞鲁维飞张超褚贝贝王江曾磊
- 关键词：单克隆抗体IGG2AIGM
- 猪TRIM11基因克隆及其促进猪伪狂犬病毒在体外增殖的研究
- 2016年
- 为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂犬病毒(PRV)刺激过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞后,于不同时间收获细胞上清,比较两组细胞上清中病毒滴度变化。结果表明,猪TRIM11的ORF长度为1 407bp,编码468个氨基酸,该氨基酸序列含有3个TRIM家族保守的结构域。组织表达谱分析显示,猪TRIM11在脂肪组织、肺的表达量较高,而在心、回肠、十二指肠、直肠中的转录量较低。成功克隆了猪TRIM11cDNA序列并构建了真核转录载体PB-TRIM11,qRT-PCR检测结果表明TRIM11在PK15细胞系中成功表达。检测感染PRV后过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞上清液病毒的TCID50发现过表达TRIM11组的病毒滴度始终高于对照组。过表达TRIM11有一定的促进PRV增殖的作用,为进一步研究猪TRIM11在天然免疫中的作用奠定了基础。
- 宋爽曾磊鲁绍芳郭珍珍鲁维飞韩立强王江王月影褚贝贝杨国宇
- 关键词：猪伪狂犬病毒病毒增殖稳定细胞系
- 犬2型腺病毒纤突蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
- 2023年
- 犬2型腺病毒(canine adenovirus-2,CAV-2)主要引起犬科动物的传染性呼吸道疾病和消化道疾病,且其传染性极强,全球范围内感染率非常高,但现有的临床防治措施难以完全阻断病毒的传播和快速特异性治疗患病动物。为了获得可用于CAV-2基础病毒学研究和临床诊治所需的单克隆抗体,本研究将浓缩纯化的CAV-HN45株灭活后免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经免疫过氧化物酶单层细胞试验和间接免疫荧光试验筛选出2株能分泌CAV FIBER蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞系:1-A12-C6、8-A12-B10,抗体亚类分别为IgG2a和IgG2b。腹水纯化后质量浓度为1 g/L抗体的间接免疫荧光效价为1-A12-C6:1∶8192;8-A12-B10:1∶2048,2株单克隆抗体均不能用于免疫印记试验检测。抗体具有体外中和病毒的活性,1-A12-C6和8-A12-B10抗体的CAV中和效价分别为1∶256和1∶64。本研究单克隆抗体的成功制备为建立快速、高效的CAV-2免疫学检测技术和CAV-2的防治提供了依据。
- 王枞嵘牛欣蕊郭江涛鲁维飞刘忠虎褚贝贝付朋飞王江
- 关键词：单克隆抗体IGG2A
- 奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控被引量：3
- 2016年
- 【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P<0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P<0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活�
- 韩立强王月影王林枫朱河水钟凯褚贝贝杨国宇
- 关键词：奶牛乳腺上皮细胞转录调控
- 猴源rab基因shRNA文库及其稳定细胞株的构建
- 2018年
- 为揭示Rab蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）入侵进入宿主细胞后的功能,本研究以PRRSV易感的猴胚胎肾上皮细胞Marc-145为模型,构建了针对猴源rab基因的短发夹RNA（shRNA）文库。此文库中的shRNA以pLKO.1为载体质粒,与pMD2.G和psPAX2包装质粒共同转染HEK293T/17细胞,获得慢病毒;利用慢病毒感染Marc-145,通过puromycin筛选获得稳定抑制猴源rab基因表达的细胞株。通过荧光定量PCR方法检测各细胞株中rab基因的敲减效率。本试验构建的文库包含187个克隆、涉及62种rab基因。荧光定量PCR结果证明,筛选出的稳定细胞株中相应rab基因mRNA的表达量均有显著下降。结果显示本试验成功构建了猴源rab基因shRNA文库并筛选出了稳定细胞株,可用于后续进一步研究Rab蛋白在PRRSV生活周期中发挥的重要功能。
- 郭珍珍鲁绍芳樊爽爽李国利韩立强鲁维飞王江陈丽颖杨国宇褚贝贝
- 关键词：PRRSV慢病毒MARC-145细胞稳定细胞系
- 猪肾上皮细胞Ⅰ型干扰素受体1敲除对伪狂犬病毒复制的影响
- 2019年
- 目的探讨Ⅰ型干扰素受体1 (IFNAR1)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。方法以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK15)敲除IFNAR1基因的稳定细胞系。运用细胞活力检测、荧光观察、流式细胞术检测、滴度测定、Real-time PCR等技术进行IFNAR1功能验证。结果随着PRV感染时间延长,敲除IFNAR1基因可以显著促进PRV-TK mRNA的转录,PRV-gE蛋白的翻译以及子代病毒的毒力。结论IFNAR1在抑制PRV增殖中发挥重要作用。
- 邵科宇张爽段利芳马英先郭玉堃李佳佳刘晓贺杜永坤褚贝贝
- 关键词：伪狂犬病病毒实时定量聚合酶链反应
- 伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究被引量：3
- 2021年
- 试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。
- 常雯茹段利芳杨乐马英先王棋翟云云周鲁豫张爽明胜利杨国宇王江褚贝贝
- 关键词：NF-ΚB
- 基于动物医学专业创新人才培养的策略研究与实践——以《分子生物学》为例的教学创新成果报告
- 2023年
- 基于“一个健康”理念和“新农科”背景下对动物医学专业创新人才的培养要求,针对《分子生物学》课程存在学生专业认同不够、学习动力不足;课程抽象,学习难度大;实验教学方式单一等“痛点”问题。本团队以专业知识为载体,充分发挥课程思政建设“主力军”作用培养学生的三农意识,以“榜样零距离”为先导激发学生自主学习的内驱力;打破传统课程框架,将现代信息技术与教学深度融合,构建产学研用案例,创设多知识点融会贯通的教学情境,通过任务驱动法引导学生自主、合作与探究式学习,培养学生的学习兴趣和解决问题的能力;采用“产教融合、校企协同、科研反哺”的实践教学方法培养学生的动手能力。经过持续的教学改革与不断完善,建成了“线上+线下+产学研用”三位一体的教学新模式,培养了一批活跃在科研一线,扎根在基层动物防疫和投身西部建设的优秀兽医学人才。
- 曾磊王江褚贝贝何文瑞张雨杭
- 关键词：分子生物学动物医学专业教学模式
