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细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-08002的克隆、表达及免疫反应性分析被引量：2: 2017年; 目的筛选细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)原头节抗原分子,并进行克隆、表达及免疫反应性分析。方法在对细粒棘球绦虫六钩蚴和原头节阶段表达的转录组测序数据进行差异分析的基础上,筛选出原头节阶段特异性表达的抗原分子。PCR扩增后克隆至p ET28a载体,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白rEg-08002,快速免染聚丙烯酰胺电泳分析表达产物;蛋白质印迹(Western blotting)分析rEg-08002的免疫反应性。ELISA分析重组蛋白rEg-08002与细粒棘球蚴病患者血清和健康人血清的免疫反应性。结果筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,大小为612 bp,构建原核表达载体pET28a-Eg-08002。快速免染聚丙烯酰胺电泳和Western blotting分析结果显示重组蛋白rEg-08002在E.coli JM109中获得高效表达,在相对分子质量(Mr)约为23 000处可见重组蛋白rEg-08002条带,主要以包涵体形式存在,r Eg-08002可被感染棘球蚴的小鼠血清识别。ELISA分析结果表明,12份细粒棘球蚴病患者血清和12份健康人血清的平均吸光度(A450)值分别为1.245±0.265和0.469±0.006,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论筛选出了原头节中高表达的抗原分子Eg-08002,获得的重组蛋白rEg-08002具有较好的免疫反应性。; 杨慧赵殷奇李子华赵嘉庆王浩王娅娜朱明星赵巍; 关键词：细粒棘球蚴克隆免疫反应性

过表达NRF-1基因对缺氧损伤大鼠心肌细胞H9c2作用的研究: 目的：　　为了研究心力衰竭的发病机制，建立了心肌细胞缺氧模型，探讨过表达 NRF-1基因是否能改善心肌缺氧造成的病理损伤，并为寻找一种新的心力衰竭治疗的靶基因奠定基础。　　方法：　　1.利用慢病毒载体建立NRF-1基因过...; 李子华; 关键词：H9C2心肌细胞缺氧损伤; 文献传递

细粒棘球绦虫原头节抗原分子Eg-01883的克隆、表达及免疫原性分析被引量：7: 2016年; 目的筛选细粒棘球蚴原头节抗原分子Eg-01883,并进行克隆、表达及免疫原性分析,为寻找棘球蚴病特异性诊断抗原提供依据。方法分析已发表的细粒棘球绦虫mRNA测序数据,筛选六钩蚴中不表达、原头节中高表达的抗原分子Eg-01883。提取细粒棘球蚴原头节总RNA,用RT-PCR对目的基因Eg-01883进行克隆,重组构建原核表达载体p ET28a-Eg-01883,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的重组蛋白r Eg-01883。ICR小鼠随机分为3组(每组12只),免疫组小鼠的背部皮下多点注射r Eg-01883,2周后加强免疫1次(剂量均为10μg,100μl/只);佐剂组注射福氏佐剂和PBS,空白对照组不作任何处理。分别于免疫前,首次免疫后1、2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后6周进行去眼球采血。用ELISA检测3组小鼠免疫后不同时间点的血清特异性Ig G抗体水平,及细胞因子白介素4(IL-4)和γ干扰素(IFN-γ)水平。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白r Eg-01883的免疫原性。结果筛选出在细粒棘球蚴原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达和纯化后获得重组蛋白r Eg-01883,该蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA检测结果显示,用纯化后的重组蛋白r Eg-01883免疫小鼠,可诱导产生特异性Ig G抗体,免疫组小鼠的血清Ig G抗体水平自首次免疫后1周开始上升,6周时达到最高水平(2.344±0.153),显著高于佐剂组(0.206 1±0.006)和空白对照组(0.241±0.01)(P<0.01)。首次免疫后6周,血清中的细胞因子IFN-γ和IL-4水平,免疫组分别为43.23 pg/ml和24.88 pg/ml,均显著高于佐剂组(21.77 pg/ml,13.27 pg/ml)和空白对照组(17.40 pg/ml,12.25 pg/ml)(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,该重组蛋白r Eg-01883抗原可被His-Tag标签抗体、免疫组小鼠血清、原头节继发感染的小鼠血清识别。结论筛选获得细粒棘球绦虫原头节中高表达的抗原分子Eg-01883,克隆、表达、纯化后的重组蛋白r Eg-; 赵殷奇李子华王浩朱明星牛楠王娅娜赵嘉庆李娜佟雪琪宋佳卉赵巍; 关键词：细粒棘球绦虫原头节免疫原性

Notch信号通路在DC介导的细粒棘球蚴重组抗原Eg.ferritin免疫过程中的作用研究被引量：2: 2014年; 目的初步探索Notch信号对树突状细胞(dendritic cell,DC)介导的抗寄生虫感染免疫反应的影响。方法体外培养骨髓来源的小鼠DC细胞,利用γ-分泌酶抑制剂N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine tbutyl ester,DAPT于不同时间段处理细胞,阻断DC的Notch信号通路,培养第7d时收集DC,用细粒棘球蚴重组抗原铁蛋白(ferritin protein of Echinococcus granulosus,Eg.ferritin)体外刺激DC,利用扫描电镜观察DC形态的改变,采用流式细胞术检测DC表面分子MHCⅡ、CD40及CD80/CD86的表达情况。结果 DC细胞数量随DAPT浓度的增高而降低;经不同浓度DAPT于不同时间段处理后,DC细胞中Notch1mRNA的表达受到抑制,以50μmol/L DAPT在第0d处理DC,对Notch1mRNA的抑制效果更显著(P<0.05);Eg.ferritin和LPS均能刺激DC细胞表面树突的生成及表面分子MHCⅡ、CD40及CD80/CD86的表达,且Eg.ferritin比LPS的刺激作用更显著(P<0.05),而加入DAPT后,DC细胞表面树突的生成减少,各表面分子的表达水平降低(P<0.05),并削弱了Eg.ferritin和LPS的刺激作用。结论Eg.ferritin能促进DC细胞的分化成熟,而阻断Notch信号通路会影响DC细胞的分化成熟,并降低DC细胞对Eg.ferritin的反应能力。其分子机制涉及Notch信号通路。; 吕士玉高富李子华王强赵巍王娅娜; 关键词：NOTCH信号通路

细粒棘球绦虫原头蚴mRNA测序及表达谱分析被引量：4: 2015年; 目的通过对细粒棘球绦虫原头蚴的mRNA的测序及表达谱分析,初步建立起细粒棘球绦虫原头蚴的表达谱数据库,了解细粒棘球绦虫原头蚴基因表达及蛋白构成情况,为全面了解细粒棘球绦虫原头蚴生物学特征及寄生虫与宿主之间的关系奠定基础并为新的诊断方法、筛选新的药物靶点和疫苗候选分子选择提供理论依据。方法用TRIZOL法提取人源细粒棘球绦虫原头蚴的总RNA,构建细粒棘球蚴的转录组测序文库,Illumina的solexa测序平台对RNA进行测序并进行生物信息学分析。结果测序结果去杂后得到2G数据,通过从头拼接我们得到18 569个contig,这些contig的总长度为71 329bp,contig平均长度为384bp,最小的contig长度为201bp,最大contig长度为4 618bp,N50(覆盖50%所有核苷酸的最大序列重叠群的长度)为384bp。预测得到unigene为9 029条,将这9 029条基因与NCBI的nr数据库做blast比对,最终有7 441条unigene具有同源比对信息。结论根据GO分析可以发现,共有10 550条unigene与数据库中的基因有较高同源性,且较多的unigene可以与多条基因相对应,一共建立了10 550条对应关系。通过与KEGG数据库进行比对分析,细粒棘球绦虫原头蚴的转录组中有4 731条unigene得到注释,这4 731个得到注释的基因位于241条代谢通路中,这些代谢通路分别与代谢过程,基因信息过程,环境相关过程,细胞过程及与人类疾病相关。; 巨艳李子华王娅娜赵嘉庆朱明星李君良赵巍; 关键词：原头蚴转录组学生物信息分析表达谱

细粒棘球蚴抗原Eg-01042的筛选、表达、纯化及免疫原性的初步研究被引量：4: 2016年; 目的研究细粒棘球蚴中的原头蚴特异性抗原Eg-01042的表达、纯化及免疫原性。方法 1分析已经公开发表的细粒棘球绦虫转录组(mRNA)测序数据,筛选六钩蚴中不表达、只在原头蚴中高表达的抗原分子Eg-01042;2人工合成获得目的基因片段,经亚克隆、诱导表达、亲和层析法纯化重组蛋白rEg-01042,并对重组蛋白进行鉴定;3BALB/c小鼠随机分为3组:rEg-01042+佐剂免疫组、PBS+佐剂对照组和空白对照组,每组21只,分别于背部皮下注射10μg rEg-01042+PBS+佐剂、PBS+佐剂(均为100μL/只),空白对照组不处理,2周后加强免疫(均为100μl/只)。分别于免疫前、首次免疫后的1、2、3、4、5、6周取眼球采血,ELISA检测各时间点3组血清的rEg-01042特异性IgG水平及细胞因子IFN-γ及IL-4水平;4利用原头蚴感染小鼠血清、rEg-01042免疫小鼠血清和小鼠空白对照组血清经Western blot分析重组蛋白的免疫原性。结果 1成功筛选出原头蚴中高表达的抗原分子Eg-01042.;2成功表达、纯化出重组蛋白rEg-01042(为包涵体蛋白);3ELISA检测结果显示,自首次rEg-01042免疫后第2、3、4、5、6周重组蛋白rEg-01042产生的特异性IgG均高于PBS+佐剂组和空白对照组(P<0.01)。首次免疫后5周,IFN-γ及血清IL-4水平高于PBS+佐剂组和空白对照组(P<0.01)。4Western blot结果显示,原头蚴感染小鼠血清和rEg-01042+佐剂免疫组血清均能识别重组蛋白rEg-01042。结论获得细粒棘球蚴差异表达抗原Eg-01042并证实重组蛋白rEg-01042具有较好的免疫原性。; 李娜赵嘉庆赵殷奇李子华朱明星赵巍; 关键词：细粒棘球蚴生物信息学诊断抗原免疫原性

包虫病诊断抗原分子Eg-00512的筛选、重组表达及抗原性鉴定被引量：5: 2017年; 目的筛选细粒棘球绦虫原头蚴抗原分子Eg-00512,并进行重组表达、纯化及免疫特性鉴定,以期作为棘球蚴病特异性诊断抗原。方法对国家人类基因组南方研究中心(CHGCS)发表的细粒棘球绦虫4个不同发育阶段的表达谱数据进行差异比较分析,筛选仅在原头蚴阶段特异表达的基因Eg-00512;利用DNAStar软件包对其编码蛋白Eg-00512进行抗原表位分析;选取合适的序列片段作为目的片段,构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经诱导表达、纯化获得重组蛋白rEg-00512。将BALB/c小鼠随机分为免疫组、佐剂对照组、PBS对照组,分别经皮下多点注射重组蛋白、PBS+弗氏佐剂和PBS,2周后加强免疫一次。分别于免疫前,第一次免疫后2、4周每组小鼠尾静脉采血,免疫后5周摘眼球法采血,采用ELISA检测各时间点血清中特异性IgG抗体水平变化;以该血清为一抗,采用Western blot分析重组蛋白的免疫反应性。结果筛选出仅在细粒棘球蚴原头蚴阶段高表达的Eg-00512基因。该基因编码203个氨基酸,分子质量单位为23ku,其抗原表位主要位于1-15、55-93、111-119、126-149、166-194和199-202氨基酸残基及其附近。成功构建基因工程菌株Eg-00512/pET-24a/BL-21,经IPTG诱导表达重组蛋白rEg-00512。重组蛋白rEg-00512纯化后免疫小鼠诱导产生特异性IgG抗体,其中免疫5周时抗体达最高水平A450值为1.807±0.767,与佐剂对照组0.111±0.014和PBS对照组0.132±0.0246比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot显示,该重组抗原可被免疫鼠抗血清及细粒棘球蚴原头蚴感染鼠血清识别,而不与正常小鼠血清反应。结论成功筛选并获得重组蛋白rEg-00512,该蛋白具有较好的抗原性,可作为棘球蚴病免疫诊断候选抗原。; 佟雪琪赵殷奇李子华朱明星王浩赵嘉庆宋佳卉牛楠徐士梅赵巍; 关键词：细粒棘球绦虫免疫原性

人源细粒棘球蚴囊壁与囊液中宿主蛋白的鉴定与分析: 2023年; 目的通过对细粒棘球蚴囊壁及囊液中的宿主蛋白成分进行鉴定,进一步阐明细粒棘球绦虫与宿主之间相互作用的现象。方法收集2022年宁夏医科大学总医院肝胆外科10例细粒棘球蚴病患者手术摘除的具有活性的完整棘球蚴包囊,同时取患者血样。无菌抽取子囊中无色透明的囊液,离心收集上清液;子囊内壁反复冲洗后剪碎,裂解匀浆,收集上清液。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒提取囊液和囊壁全蛋白,经过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳后,切取囊壁全蛋白泳道显著的蛋白条带,进行质谱检测,进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。对患者血清和囊液的生化成分浓度进行定量检测。结果10例细粒棘球蚴病患者的肝脏功能为Child-Pugh A或B级。病灶直径为2.9~16.3 cm,为WHO-IWGE分型的CE2(多子囊型)或CE3(内囊塌陷型)。SDS-PAGE电泳分析结果显示,棘球蚴囊壁蛋白在相对分子质量(Mr)为70000、50000、25000处显示出清晰的蛋白条带,囊液蛋白在Mr 70000显示出清晰的蛋白条带。蛋白质谱与Western blotting结果均显示,相对分子质量在约Mr 70000的蛋白中包含人血白蛋白,约Mr 50000的目标蛋白为人IgG重链,约Mr 25000的目标蛋白为人IgG轻链。各生化指标中,囊液和血清中的中K+浓度分别为(5.53±0.86)mmol/L和(3.92±0.33)mmol/L,白蛋白浓度分别为(0.57±0.46)g/L和(39.42±2.77)g/L,胆固醇浓度分别为(0.03±0.02)mmol/L和(3.79±1.53)mmol/L,三者在囊液和血清中的浓度差异有统计学意义(t=5.56、43.71、7.74,P<0.05)。结论宿主来源的血清白蛋白和抗体是细粒棘球蚴囊壁和囊液中含量较高的宿主蛋白。; 李涛李子华张翠影赵巍; 关键词：细粒棘球绦虫白蛋白抗体囊壁囊液

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李子华

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