罗晓丽
- 作品数：11 被引量：13H指数：2
- 供职机构：军事医学科学院生物工程研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金北京市科技新星计划北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生化学工程更多>>
- 核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位被引量：1
- 2015年
- 目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。
- 罗晓丽周蕾丁丽华张亚楠刘婕贾晓蒙陈滢洁熊加秀陈志达叶棋浓赵丽纯
- 关键词：克隆细胞定位
- Twist1稳定表达细胞株的建立及对乳腺癌细胞上皮-间充质转变的影响被引量：2
- 2016年
- 目的:构建Twist1的慢病毒真核表达载体,并建立稳定表达Twist1的乳腺癌细胞株,研究Twist1在乳腺癌中对上皮-间充质转变(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Twist1编码序列,克隆到慢病毒p CDH载体,构建成p CDH-Twist1,转染293T细胞,Western印迹鉴定p CDH载体介导的Twist1的表达;包装病毒载体,感染ZR75-1细胞,用嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响。结果:经Bam HⅠ、Eco RⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Twist1表达载体,Western印迹实验发现Twist1在293T细胞内表达;嘌呤霉素筛选得到稳定表达Twist1的ZR75-1细胞株。结论:构建了p CDH-Twist1的真核表达载体并建立了稳定表达Twist1的ZR75-1细胞,为进一步研究Twist1在EMT过程中的机制奠定了基础。
- 宋玉华陈滢洁张亚楠刘婕罗晓丽贾晓蒙李欣姜潇丁丽华叶棋浓
- 关键词：TWIST1E-钙黏蛋白乳腺癌细胞
- 微管结合蛋白Tau磷酸化位点突变体的构建及鉴定被引量：1
- 2016年
- 目的:构建带有Myc标签的Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的Tau蛋白真核表达质粒,并在真核细胞中表达Myc-Tau3m蛋白。方法:利用重组PCR方法得到Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变为Ala的编码序列,将其插入经Bam HⅠ和KpnⅠ酶切的p XJ40-Myc表达载体,在人293T细胞中转入空载体和重组质粒,利用Western印迹检测其表达及功能。结果:测序和酶切结果证实Myc-Tau3m真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达,表达产物可促进微管的乙酰化。结论:构建了Thr-213、Thr-235、Ser-404磷酸化位点突变的Myc-Tau3m真核表达载体,为进一步研究Tau蛋白磷酸化的生理机能奠定了基础。
- 贾晓蒙张亚楠罗晓丽陈滢洁丁丽华叶棋浓吕朝晖
- 关键词：突变体磷酸化真核表达
- Snail真核表达载体的构建及功能鉴定
- 2016年
- 目的:构建Snail的慢病毒真核表达载体,并研究Snail在肿瘤发生和发展过程中对上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Snail的全长编码序列,将其克隆到p CDH表达载体上,构建成p CDH-Snail真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测p CDH载体介导的Snail的表达;与包装质粒共转染293T细胞,包装病毒后感染ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选2周,得到稳定表达Snail的ZR75-1细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响,同时用倒置荧光显微镜观察ZR75-1稳定细胞株中上皮钙粘蛋白分布的变化。结果:Bam HⅠ、XbaⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Snail表达载体,Western印迹表明Snail在293T细胞内得到成功;经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达Snail的ZR75-1细胞株;在倒置荧光显微镜下观察,ZR75-1稳定细胞株中的上皮钙粘蛋白绿色荧光明显减弱。结论:构建了p CDH-Snail的慢病毒真核表达载体,建立了稳定表达Snail的ZR75-1细胞,为进一步研究Snail在EMT过程中的机制奠定了基础。
- 陈滢洁姜潇李欣张亚楠刘婕罗晓丽贾晓蒙丁丽华叶棋浓宋玉华
- 关键词：SNAIL上皮钙粘蛋白上皮-间质转化真核表达载体
- 带Myc标签的人B55α真核表达载体的构建及其生物学功能
- 2016年
- 目的:构建带有Myc标签的人B55α真核表达载体,获得Myc-B55α融合蛋白,并初步检测其生物学功能。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增出B55α编码序列,将其插入p XJ-40-myc载体,Western印迹检测其表达情况;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测B55α蛋白表达水平及其对AKT磷酸化的影响;免疫共沉淀实验检测B55α与AKT是否存在相互作用。结果:双酶切和测序结果表明Myc-B55α真核表达质粒构建成功;Western印迹证实转染293T细胞后Myc-B55α融合蛋白获得表达,并可抑制AKT308的磷酸化;免疫共沉淀结果表明B55α与AKT存在相互作用。结论:构建了带Myc标签的人B55α真核表达载体,为进一步研究B55α在蛋白磷酸化修饰功能中的作用奠定了基础。
- 贾晓蒙孙银萍张亚楠罗晓丽陈滢洁刘婕丁丽华叶棋浓吕朝晖
- 关键词：克隆真核表达
- GFP-LC3B真核表达载体的构建及表达鉴定
- 2015年
- 目的:构建人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B,并鉴定其表达。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增LC3B全长基因,将其克隆至p EGFP-C1表达载体,得到p EGFP-C1-LC3B重组质粒,酶切和测序鉴定后,转染ZR75-1细胞,Western印迹检测真核细胞中GFP-LC3B融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察自噬诱导剂雷帕霉素处理和未处理ZR75-1细胞质中GFP-LC3B的分布。结果:Western印迹可见GFP-LC3B融合蛋白表达条带;在荧光显微镜下,ZR75-1细胞内可见绿色荧光,雷帕霉素刺激后有明显绿色荧光聚集体形成。结论:人自噬相关基因LC3B的真核表达载体p EGFP-C1-LC3B构建成功,为进一步研究自噬在乳腺癌细胞中的作用机制奠定了基础。
- 朱杰丁丽华刘婕禾荣华张亚楠陈志达罗晓丽叶棋浓吕朝晖
- 关键词：自噬真核表达载体绿色荧光蛋白
- DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定被引量：2
- 2015年
- 目的构建DEK基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经Bam HⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA(siRNA)表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素(puromycin,puro)筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应(real time-PCR,RT-PCR)和Western印迹分别检验DEK在信使RNA(mRNA)和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明,DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。
- 朱杰刘婕丁丽华禾荣华张亚楠陈志达罗晓丽叶棋浓吕朝晖
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体
- 磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体的构建及其生物学功能研究
- 2016年
- 目的:构建磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体,并瞬时转染胃癌耐药细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法:以带有pc DNA3.0-Flag标签的Akt1质粒为模板,采用重组PCR技术扩增得到Akt1(T308A)(苏氨酸突变成丙氨酸)、Akt1(T308E)(苏氨酸突变成谷氨酸)位点突变编码区序列,将其插入pc DNA3.0-Flag载体,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP,通过Western印迹和实时定量PCR检测Notch1蛋白和m RNA水平的变化,通过CCK-8法检测对耐药细胞生长曲线的影响。结果:双酶切和测序结果表明Akt1(T308A)、Akt1(T308E)的真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP后,利用实时定量PCR和Western印迹证明去磷酸化Akt1(T308A)可抑制Notch1的转录和蛋白水平,模拟持续磷酸化Akt1(T308E)升高Notch1的转录和蛋白表达;细胞生长曲线结果显示,转染Akt1(T308A)较空载体耐药细胞生长慢,而Akt1(T308E)促进耐药细胞生长。结论:PI3K/Akt与Notch1信号通路的激活在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用。
- 熊加秀丁丽华刘文忠张亚楠陈志达罗晓丽贾小萌陈滢洁叶棋浓卫勃
- 关键词：AKT1NOTCH1点突变
- CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达
- 2014年
- 目的构建携带CDCP1胞外段基因的原核表达载体。方法以A549的mRNA为模板,应用所设计的引物通过RT-PCR法扩增CDCP1胞外段基因;将PCR产物与pGEX-KG载体连接,获得重组质粒pGEX-KG/CDCP1;经双酶切、PCR及DNA序列测定进行鉴定;IPTG诱导表达。结果①RT-PCR扩增得到约270bp大小的CDCP1胞外段基因目的片段;②目的片段正确插入到pGEX-KG中;③经IPTG诱导表达,可见在相对分子质量约35kD处出现明显的诱导蛋白条带,与预期一致。结论成功构建了携带CDCP1胞外段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中获得大量表达。
- 李玲霞王志巧罗晓丽宋丽娜于珊珊何成彦赵丽纯李洪军赵海丰武利涛
- 关键词：基因克隆
- 慢病毒载体介导E6AP基因敲低乳腺癌细胞株的构建及其功能检测被引量：1
- 2014年
- 目的构建E6AP基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成两条E6AP基因的siRNA,并将其与siRNA表达载体p SIH-H1连接。经过酶切和测序鉴定成功后,人胚肾细胞293T包装E6AP siRNA的慢病毒,然后感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低E6AP表达的稳定细胞株。稳定细胞株建立后通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹等方法检测RNAi的干扰效果,并利用细胞生长实验检测E6AP siRNA对乳腺癌细胞生长的影响。结果 DNA测序证明,成功构建了E6AP siRNA的表达载体。实时定量PCR和Western印迹实验证明,构建的siRNA确能有效抑制E6AP基因的表达,并建立了敲低E6AP表达的稳定细胞株。生长实验表明,E6AP siRNA可有效抑制细胞的生长。结论成功构建E6AP基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制E6AP基因的表达,且抑制细胞ZR75-1的生长。
- 陈志达丁丽华刘婕张亚楠朱杰罗晓丽刘国晓叶棋浓卫勃
- 关键词：基因表达乳腺肿瘤
