刘金雷
- 作品数：11 被引量：18H指数：3
- 供职机构：河北科技大学生物科学与工程学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技支撑计划“十二五”国家科技计划农村领域更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程农业科学更多>>
- 基于CRISPR-Cas9系统的Saccharomyces cerevisiae基因删除被引量：1
- 2019年
- 建立CRISPR-Cas9介导的在Saccharomyces cerevisiae双倍体细胞中进行基因敲除的方法。以can1基因敲除后的表型验证该CRISPR-Cas9系统的有效性,can1基因的失活效率达到4%。利用该系统又分别敲除了pdc、adh3、adh2、adh1、 pdh等基因,单基因编辑效率分别为4/48、3/48、1/48、3/28、1/16。确定了基因连续敲除的方法流程,pdc、adh3、adh2三个基因全部敲除,整个过程用时17 d。探索了双基因一次转化同时敲除的方法,将adh5、lip两个基因同时敲除用时6 d,基因编辑效率分别为9/32和10/32。
- 牛潇迪李天明刘金雷杨天勇李子怡冯惠勇
- 关键词：酿酒酵母基因组工程基因敲除
- 谷氨酸棒状杆菌新型诱导启动子的研究被引量：1
- 2016年
- 以丰富和完善谷氨酸棒状杆菌的表达元件、筛选适合工业化应用的新型诱导启动子为研究目标,借助绿色荧光蛋白GFP为报告基因,构建启动子筛选工具质粒,在谷氨酸棒杆菌中表达,筛选出三种高效表达的诱导启动子.通过检测绿色荧光蛋白表达强度可知:丙酸启动子诱导表达强度最大,葡萄糖酸启动子次之,蔗糖启动子较弱;丙酸启动子最适诱导浓度为60 ug/m L、葡萄糖酸启动子2 mg/m L、蔗糖启动子2 mg/m L,表达强度比无诱导对照组分别增加4.39、3.86、2.74倍.
- 范荣刘金雷韩武洋许湄雪陆浩仪宏李天明
- 关键词：谷氨酸棒状杆菌
- 代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生成丙酮酸被引量：3
- 2016年
- 旨在增加谷氨酸棒杆菌代谢过程中丙酮酸的积累、减少副产物的生成,利用同源重组的方法,敲除了丙酮酸代谢过程中支流代谢途径的关键基因:丙酮酸醌氧化还原酶pqo基因、丙酮酸脱氢酶pdh基因和乳酸脱氢酶lldh基因,获得了基因缺失工程菌株。利用4.5%的葡萄糖复合培养基,工程菌经摇瓶发酵48 h,丙酮酸的浓度达到14.6 g/L,而野生菌株仅为0.45 g/L;工程菌的糖酸转化率为33.18%,比野生菌提高了32.5倍。
- 于莹许湄雪刘金雷范荣冯惠勇李天明
- 关键词：丙酮酸谷氨酸棒状杆菌丙酮酸脱氢酶乳酸脱氢酶
- 谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢阻断工程菌的构建被引量：5
- 2017年
- 采用反向代谢工程的策略,以谷氨酸棒杆菌ATCC 13032野生型为出发菌株,利用无抗性标记的同源重组方法,敲除了编码葡萄糖pts系统关键转运蛋白基因ptsG、ptsH-ptsI和葡萄糖转运系统关键转运蛋白基因abc、abc2和iolt1,得到了5株逐次敲除了相应基因的突变株。结果表明:当以葡萄糖为唯一碳源培养时,CGΔptsG菌株的葡萄糖的消耗是野生型的50%,菌体OD值为1.473;CGΔptsH-ptsI菌株的葡萄糖的消耗是野生型的39.5%,菌体OD值为1.226;CGΔabc菌株的葡萄糖的消耗是野生型的36%,菌体OD值为1.092;CGΔabc2菌株的葡萄糖的消耗是野生型的26.2%,菌体OD值为0.486;CGΔiolt1葡萄糖的消耗和菌体生长OD值为0,实现了谷氨酸棒状杆菌葡萄糖代谢的阻断,说明ptsG、ptsH-ptsI、abc、abc2和iolt1所编码的转运蛋白具有葡萄糖转运功能。
- 韩武洋刘金雷杜红燕王北辰仪宏李天明
- 关键词：谷氨酸棒状杆菌葡萄糖基因敲除
- Corynebacterium glutamicum组成型启动子及核糖体结合位点的研究
- 2017年
- 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)是一种广泛用于工业生产的生物安全性菌株。本研究旨在丰富组成型启动子表达元件库,从C.glutamicum ATCC 13032中克隆了5种基因启动子,分别为锰超氧化物歧化酶基因启动子(psod)、延伸因子基因启动子(ptuf)、三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(pgap)、苹果酸合成酶基因启动子(pms)和二氢吡啶二羧酸合酶基因启动子(pa16)。通过构建工具质粒,以绿色荧光蛋白基因(gfp)为报告基因,研究了这5种基因启动子的启动活性。结果表明5种基因启动子的启动活性由高到低依次为pa16、psod、pms、ptuf和pgap,荧光强度分别为465 RFU/OD_(600)、420 RFU/OD_(600)、305 RFU/OD_(600)、200 RFU/OD_(600)和175 RFU/OD_(600)。此外,基于已构建的载体pa16gfp-p XMJ19,以卡那霉素为报告基因,构建了包含两个核糖体结合位点序列(CGAAAGGATTTTTTACCC及CAGGAGGACATACA)的psod和ptuf的验证质粒,为构建不同C.glutamicum工程菌提供了可选择性调控元件。
- 王崇慧韩武洋陆浩赵一刘金雷王丽丽李天明
- 关键词：谷氨酸棒杆菌组成型启动子报告基因绿色荧光蛋白
- 代谢工程改造Corynebacterium glutamicum生产L-苹果酸被引量：1
- 2016年
- 以提高L-苹果酸的产量为目标,采用一次交换两次同源重组的方法,利用反向筛选标记,在敲除了丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo),丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的C.glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C.glutamicumΔPPL)基础上,无痕敲除了L-苹果酸积累支流代谢途径的2个关键酶基因:苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)和苹果酸酶编码基因(male),同时敲入了苹果酸分泌转运蛋白基因(transb),获得了产L-苹果酸的工程菌株;采用高效液相色谱法检测了工程菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的发酵产物。实验结果表明:C.glutamicum ATCC 13032发酵后不积累L-苹果酸,而工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale发酵48 h,积累了12.8 g/L的L-苹果酸,工程菌的糖酸转化率为33.18%,为利用C.glutamicum ATCC 13032发酵生产L-苹果酸提供了基础遗传资源。
- 赵一李天明刘金雷王崇慧仪宏冯惠勇
- 关键词：L-苹果酸基因敲除基因敲入
- 代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸被引量：1
- 2014年
- 2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。
- 仪修南李天明王北辰刘金雷杜红燕冯惠勇
- 关键词：2-酮基-D-葡萄糖酸葡萄糖氧化酶
- 构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因缺失菌株实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰
- 2016年
- 弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)可高效不完全氧化多种糖类和醇类等多羟基化合物,生成相应的醛类、酮类和有机酸类等产物,是一类重要的工业微生物。利用同源重组技术对基因组进行修饰改造是工业育种的有效手段。传统方法多选用抗生素为筛选标记,存在诸多缺陷。构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因缺失菌株以实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰为目标,将自杀质粒p MD18-Jqupp电转化至野生型Gluconobacter suboxydans J12中,通过四环素抗性和5-氟尿嘧啶双重筛选,获得敲除了编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶的基因upp的突变株。经生理验证表明,该突变株在含0.5mg/ml 5-氟尿嘧啶的培养基上生长,而回补upp基因后,在0.5mg/ml 5-F氟尿嘧啶的培养基上不生长。说明获得的G.suboxydans-upp突变株能以upp基因作为负向筛选标记,通过两次同源重组,实现Gluconobacter suboxydans基因组无痕修饰与改造,为今后代谢工程改造Gluconobacter suboxydans获得有价值的工业菌种奠定基础。
- 杜红燕李天明刘金雷冯惠勇
- 关键词：尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因敲除
- 基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建被引量：2
- 2017年
- 通过构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)敲除打靶质粒,采用同源重组的方法获得了生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)的upp基因缺失突变株K.vulgareΔupp,可作为基因组无痕修饰系统底盘细胞的upp基因表达载体,转化突变株K.vulgareΔupp,获得upp基因回补菌株PBB-upp,并验证了upp作为负向筛选标记的可行性。实验结果表明:突变株Δupp在1 mg/m L的5-氟尿嘧啶培养基上可生长,野生型和回补菌株PBB-upp不能生长,3株菌对5-氟尿嘧啶的抗性存在显著差异,说明可以将upp基因作为负向筛选标记,与正向筛选标记相结合,在upp基因缺失的底盘细胞基础上通过两次同源重组,实现基因组的无痕修饰与改造。
- 陆浩李天明刘金雷杜红燕王北辰冯惠勇
- 关键词：5-氟尿嘧啶
- 木质素降解酶系在毕赤酵母中的表达及降解木质素的活性被引量：4
- 2015年
- 自然界中的木质素是潜在的丰富的可再生资源,近年来利用生物法降解木质素成为研究的热点。利用RT-PCR克隆了黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)木质素过氧化物酶基因(Li P)、锰过氧化物酶基因(Mn P)、黑曲霉(Asperillus niger)葡萄糖氧化酶基因(gox)及白腐真菌(White Rot Fungi)漆酶基因(Lac),并构建了毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体,电转化入Pichia pastoris X-33宿主菌中,获得转化子并进行微培养,通过测定培养液的酶活,筛选出高酶活菌株。对4种重组菌株进行发酵,以经过处理的玉米皮作为底物,分别加入4种酶的发酵液及4种酶的混合液,于30℃反应后测定不同反应时间木质素的降解量,反应24h,木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、漆酶吸光度D280nm的降低幅度分别为45%、39%、9%、57%;复合酶降解木质素的活性明显高于单一酶,吸光度的降低幅度为78%,说明木质素降解酶系的相互协同作用,提高了木质素的降解效率,为木质素酶解提供了新方法。
- 刘金雷刘天佳于莹李天明仪宏
- 关键词：木质素异源表达毕赤酵母酶活性
